Kä ye guöp cɔk ril yiic aye kä thiekiic ye tɔ̈ në pinynhom (TME) yic, ku ke nɔŋ kä lik cï kek nyaai, ke tɛ̈n yenë kek ŋic thïn acïï ŋic apɛi. Ëtënë, ɣok acï thɛ̈mthɛ̈m ku T cells thɔ̈ɔ̈ŋ tënë thɛ̈mthɛ̈m ku thɛ̈mthɛ̈m ë kɔc tuany nɔŋ thɛ̈mthɛ̈m dït ë thɛ̈mthɛ̈m (HGSC) bïk thɛ̈mthɛ̈m ë thɛ̈mthɛ̈m ë TME wääc yiic nyuɔɔth. Ascites ku räl ke tumor aanɔŋ kä juëc wääc ke räl ke rïŋ. Të thɔ̈ɔ̈ŋë yen kenë pïu ë nhom, ke T ë pïu ë nhom ë pïu yiic aye dït apɛi në 1-mëthylnikotïnamide (MNA). Na cɔk tɔ̈ ke tɔ̈ në MNA yic në T cells yiic, ke luɔɔi de nicotinamide N-methyltransferase (enzyme ye akuɔ̈tnhïïm ke methyl cɔk lɔ në S-adenosylmethionine yic agut cï nicotinamide) ee tɔ̈ ke ye kë thiin koor tënë fibroblasts ku jɔl ya räl ke tumor. Në luɔɔiden yic, ke MNA ee T cells cɔk bɔ̈ bei agokë tuanytuɛɛny ya cɔk lɔ tueŋ apath. Ku na yïn ya, ke MNA cï bɛ̈nbei në TME yic ee T cells cɔk tɔ̈ apath ku ye raan cɔk tɔ̈ ke ye raan lëu bï tuanytuɛɛny ke cancer ya töök.
Kä ye yök në tumor yic aye naŋ kë dït ye gël në gël de tuanytuɛɛny yiic, ku käjuëc ke yith aye nyuɔɔth lɔn lëu bïk ya luui ëyadɛ̈ ke ye kë ye tuanytuɛɛny cɔk lɔ tueŋ (1). Në kë de kë cï rot looi në Warburg yic, ke luɔɔi cï piac looi acï rot jɔɔk bï kä ye röt looi në thɛɛr ke tɔ̈c yiic ya nyuɔɔth ku jɔl ya ruääiden kenë tɔ̈c de guöp (TME). Puɔ̈ɔ̈c cï looi në col ku jɔl ya T cells ke raan yiic acï ya nyuɔɔth ke glutamine (2), glutamine (3) ku jɔl ya glucose (4) alëu bïk ya luui keepɛ̈i në akuɔ̈tnhïïm thi kɔ̈k peei yiic. Käjuëc ye röt waar në kee dhɔ̈l käkë yiic aye luɔɔi de T cells gël. Acï ya nyuɔɔth ke gël de kä ye tɔ̈ në guöp yic (BH4) alëu bï ciin de T cells ya riɔ̈ɔ̈k, ku juɛ̈k-juɛ̈k de BH4 në guöp yic alëu bï tuanytuɛɛny ya cɔk tɔ̈ apath në CD4 ku CD8 yiic. Në ye kënë yic, ke gël de guöp ë raan ëbɛ̈n alëu bï ya kony në tɔ̈ɔ̈u de BH4 (5). Në thɛɛr ke tɔ̈c yiic, ke tɔ̈c de tɔ̈c de tɔ̈c (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) ee T cell gël bïk cïï lui, bïk röt juak ku bïk röt juak (6). Në ye akäl käk yiic, ke ka cï ya nyuɔɔth ke methylglyoxal, man ye ya kë ye yök në glycolysis yic, ku ka ye ya looi në kä ye tɔ̈ në thɛɛr ke myeloid yiic, ku T cells ye tɔ̈ në thɛɛr ke tɔ̈c yiic alëu bïk luɔɔi de T cell ya gël. Në töök yic, ke tɔ̈ɔ̈u de methylglyoxal alëu bï luɔɔi de mɛ̈l ë nhom (MDSC) ya tiaam ku bï töök ya cɔk tɔ̈ ke cïn kë ye yök në dhɔ̈l ke col yiic (7). Kä cï kek kueen käkë aye luɔɔi thiekic de TME-ye yök në luɔɔi de T cell yic ku jɔl ya luɔɔiden yic bɛ̈n ya nyuɔɔth.
T cell ë thök ë luɔi acï lueel apɛi në tuaany de nhom (8). Kän ee rot looi në kë de aciëëk ke mïïth yiic ye tɔ̈ në pïu yiic ku jɔl ya pïu yiic (9), man ye glucose ku tryptophan cɔk ye kä kɔ̈k peei cïmën de lactic acid ku kynurenine. Lactate juëc apɛi ee luɔɔi de γ (IFN-γ) cɔk tɔ̈ piiny ku ye wuɔ̈ɔ̈c de akuɔ̈tnhïïm thiik ke rim cɔk tɔ̈ piiny (10, 11). Kuïn de tryptophan ee T cell ë thäät yiic gël ku gël ë T cell ë thäät yiic (12-14). Ke käjuëc cï kek ya tïŋ käkë ya ŋoot ëke cï kek ya tïŋ, ke luɔɔi dïït cï ya looi në luɔɔi de vitro T cell yic në luɔɔi de wël cï kek juiir yiic, ka cï kek ya tääu në dhɔ̈l ke col yiic në vivo yic, ku ka cïn töŋ de kek ye tuanytuɛɛny ke cancer ke raan ya nyuɔɔth apath ku jɔl ya käjuëc ke pinynhom.
Kë ye lac yök në tuaany de nhom yic ee tɔ̈c de nhom ku tɔ̈c de nhom. Kuɛ̈ny ë pïu ë cell yiic në ascites yic ee thiääk kenë tuany dït ku thök ë thök ë thök (15). Cït tɛ̈n cenë ye lueel thïn në wël cï kek lueel yiic, ke biäk kënë ee tɔ̈ ke cïn aliir, ku ka nɔŋ käjuëc ye rim cɔk cil (VEGF) ku jɔl ya rim ye rim cɔk cil (IDO), ku ka ye tɔ̈ në rim yiic në T ye rim mac ku ye rim gël (15-18). Të yenë ascites rot luɔɔi thïn alëu bï ya wuɔ̈ɔ̈c kenë tɛ̈n yenë tumor rot luɔɔi thïn, ku këya, tɛ̈n yenë T cells röt bɛɛr looi në ɣän ke pïu yiic acie ŋic apath. Në ye kënë yic, ke wuɔ̈ɔ̈c de kä thiekiic ku kä wääc në kaam de ascites ku metabolites tɔ̈ në ɣän ke tumor yiic alëu bïk tɔ̈c de kä ye guöp gël ku luɔɔiden në tumor yiic ya gël, ku ka wïc bï ya wïc bï ya wïc bï ya yök në rïthäc dɛ̈t peei yic.
Në kë bï kä dhal kɔc käkë ya cɔ̈kpiny, ɣok acï dhöl yenë käŋ tek yiic ku jɔl ya dhöl benë käŋ ya tek yiic (LC-MS/MS) ya looi agoku käjuëc wääc ya puɔ̈ɔ̈c (cïmën de CD4 + ku CD8 + T cells) ku jɔl ya tɔ̈ në kaam de tumor yiic. Wɔ ye dhöl kënë luɔ̈ɔ̈i në tök kenë thëm de kä juëc ye cath në pïu yiic ku jɔl ya thëm de RNA tök (scRNA-seq) ago thura dït apɛi ya nyuɔɔth në tän de mïïth yiic në kee akuɔ̈tnhïïm käkë yiic. Kuer kënë acï 1-methylnicotinamide (MNA) tɔ̈ në T cells yiic nyuɔɔth, ku në thëm cï looi në vitro yic acï nyuɔɔth ke tɔ̈c de MNA në luɔɔi de T cells yic akëc ŋic wënthɛɛr. Në wël kedhiɛ yiic, ke dhöl kënë ee käjuëc ye röt looi në kaam de tumors ku jɔl ya kä ye guöp gël në guöp yiic ya nyuɔɔth, ku ye wël juëc wääc yiic bɛ̈i në tɛ̈n yenë guöp guöp gël thïn, man lëu bï ya piath në töök de tuanytuɛɛny ke T cells ye tɔ̈ në ovarian cancer yic.
Ɣok acï thëm dït ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl) amino)-2-deoxyglöcose (2-NBDG) ku luɔi ë thëm ë thëm [MitoTracker Deep Red, DR1) kä ye nyuɔɔth ë ke ye kä ye guɔ̈p gël ku ciin de kä ye yök në tuanytuɛɛny yiic tek thook (Table S2 ku Thura S1A). Kë cï tïŋ kënë acï nyuɔɔth lɔn nadë ke thööŋë kenë T cells, ke ascites ku tumor aye naŋ glucose dït apɛi ye kek dɔm, ku ka nɔŋ kä thiik wääc në luɔɔi de mitochondria yic. Aciëŋ de glucose ë CD45-EpCAM (EpCAM)+] ee tɔ̈ në thää kaadiäk agut cï thää kaaŋuan tënë CD4 + T, ku glucose ë CD4 + T ee 1.2 ë CD8 + T, ku ye nyuɔɔth lɔn ye glucose ë CD8 + T yök (TIL wïc T1). Në thööŋ, ke luɔɔi de mɛ̈c tɔ̈ në mɛ̈c yiic ee thöŋ ke mɛ̈c ke CD4 + T, ku mɛ̈c ke mɛ̈c kedhiɛ ee dït apɛi në mɛ̈c ke CD8 + T (Thiɛ̈ŋ 1B). Në wël kedhiɛ yiic, ke kä cï kek yök ëtënë aye tɔ̈c de mïïth nyuɔɔth. Tɛ̈n ë tɔ̈ɔ̈u de mïïth ë thäät yiic ee dït apɛi tënë CD4 + T, ku tɔ̈ɔ̈u de CD4 + T ee dït apɛi tënë CD8 + T. Na cɔk ya tɔ̈ ke nɔŋ käjuëc ye röt looi në cells yiic, ke ka cïn kë ye wuɔ̈ɔ̈c në tɛ̈n yenë CD4 + ku CD8 + T cells röt luɔɔi thïn ka tɛ̈n yenë kek thɔ̈ɔ̈ŋ thïn në ascites yic të thööŋë kek kenë tumors (Thiɛ̈ŋ 1C). Në thööŋ, në CD45-ciɛ̈ŋ yic, ke ciin de EpCAM+ tɔ̈ në tɔ̈ɔ̈u yic ee rot juak të thööŋë yen kenë tɔ̈ɔ̈u de pïu (Thiɛ̈ŋ 1D). Ku ɣok aacï wuɔ̈ɔ̈c de mïïth ë guöp tïŋ ëyadɛ̈ në kaam de EpCAM+ ku EpCAM- ë mïïth ë guöp. EpCAM+ (tumor) ë nhom anɔŋ glucose dït apɛi ku ë nhom ë nhom ë EpCAM- nhom, ku yen ee nhom dït apɛi ë nhom ë nhom ë nhom ë nhom ë TME (Thöŋ 1, E ku F).
(A ku B) Kë tɔ̈ ciɛɛl de pïu ë pïu yiic (MFI) de pïu ë pïu yiic (2-NBDG) (A) ku luɔɔi de pïu ë pïu yiic ë CD4 + T (MitoTracker col thith) (B) Kä ye nyuɔɔth (ciëën) ku wël cï keek gɔ̈t (ciëën), CD8 + T pïu yiic ku EpCAM + T pïu yiic ku EpCAM + T pïu yiic ku EpCAM + T pïu yiic ku EpCAM + T pïu yiic. (C) Tɛ̈n ë CD4 + ku CD8 + ë thäät (ë CD3 + T ë thäät) ë thäät ë thäät ku thäät ë thäät. (D) Ciin de EpCAM + ë tɔ̈c ë nhom ku tɔ̈c ë nhom (CD45−). (E ku F) EpCAM + CD45-tumor ku EpCAM-CD45-tumor ë glucose ë yök (2-NBDG) (E) ku luɔi de mïïth ë nhom (MitoTracker thith col) (F) ë thööŋ ë nhom ë nhom (ciëën) ku wël cï keek gɔ̈t (ciëën) Ascites ku nhom ë nhom ë nhom. (G) Kä ye CD25, CD137 ku PD1 nyuɔɔth në thëm de pïu ë pïu yiic. (H ku I) CD25, CD137 ku PD1 ë thööŋ ë CD4 + T ë thööŋ (H) ku CD8 + T ë thööŋ (I). (J ku K) Kë cïn kë ŋic, nhom ciɛɛl (Tcm), nhom ë nhom (Teff) ku nhom ë nhom (Tem) ë nhom ë thäät ë thäät ë CCR7 ku CD45RO. Thura ye tɔ̈u në nyin de kɔc yiic (ciëën) ku wël cï keek gɔ̈t (ciëën) ke CD4 + T (J) ku CD8 + T (K) në pïu yiic ku pïu yiic. P thööŋ ë thööŋ ë t-thëm ë rou (*P<0,05, **P<0,01 ku ***P<0,001). Lany ee kɔc tuany thöŋ nyuɔɔth (n = 6). FMO, pïu ë pïu ë pïu ë pïu; MFI, tɔ̈u ciɛɛl de riɛl de ɣɛɛr.
Cɛɛth dɛ̈t cï looi acï wuɔ̈ɔ̈c dɛ̈t thiekic bɛ̈n nyuɔɔth në kaam de tän de T cell cï juiir apɛi. Kë cï looi (Thiɛ̈ŋ 1, G agut cï I) ku kë cï looi (Thiɛ̈ŋ 1, J ku K) në tɔ̈ɔ̈u yic aye lac yök awär tɔ̈ɔ̈u (ciin de CD3 + T cells). Cïmën de, thëm de kä ye röt looi në luɔɔi de kä ye röt looi (CD25 ku CD137) ku kä ye röt looi [ajuɛɛr de thou de cell 1 (PD1)] acï nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke cɔk alɔn yenë käke pïïr de raan ëbɛ̈n wuɔ̈ɔ̈c (Thiɛ̈ŋ S1, B agut cï E) , Ku ka cïn kä thiekiic wääc ke kä ye röt looi në kaam de S1. F agut cï Ɣ). Kä cï bɛ̈n bei thïn käkë aacï keek yök në luɔɔi de dhɔ̈l ke piööc de adit bïk käke gup ke raan ëbɛ̈n ya tääu në gupken yiic (21), ku kën acï ŋoot ke ye nyuɔɔth lɔn nɔŋ yen gup juëc ke gup ke raan tuany (Thöŋ S2A ). Në käk cï kek yök yiic kedhiɛ, ke ciin de mïïth ke myeloid käkë aye glucose dït apɛi nyuɔɔth ku jɔl ya luɔɔi de mïïth (Thiɛ̈ŋ S2, B agut cï G). Kä cï bɛ̈n bei kënë aye wuɔ̈ɔ̈c ril de mïïth nyuɔɔth në kaam de käjuëc ke cells ye kek yök në ascites ku tumors yiic në kɔc tuany ke HGSC yiic.
Kë ril yic apɛi bï aciëëk ke TIL ya deetic ee bï T cell ya tek thook në käjuëc yiic, piathden ku jɔl ya dïtden tënë tumors. Kä cï kek piac ya puɔ̈ɔ̈c në yemɛɛn aacï ya nyuɔɔth ke tɛ̈n yenë käŋ tɛ̈ɛ̈kic ku jɔl ya tɛ̈n yenë käŋ tääu thïn në thëm de käŋ yiic, alëu bïk käŋ ya waar yiic në thɛɛr juëc yiic (22-24). Ku bï kërac kënë ya tiaam, ɣok acï dhöl de gɛ̈m de bead ya looi ago TIL ya tek thook ku bï ya tek thook tënë tuany ë nhom de raan cï tɔ̈ɔ̈u në tɔ̈ɔ̈u yic ke kënnë LC-MS/MS kɔn ya thɔ̈ɔ̈ŋ (tïŋ Käŋ ku Kuɛɛr; Thura 2A). Në kë bïnë këriɛ̈ɛ̈c ëbën cï rot looi në ye löŋ kënë yic ya tïŋ në kä ye röt waar yiic, ɣok acï kä ye röt waar ke T cells cï kek ya looi në kɔc cï pial gup bɛ̈n ya thɔ̈ɔ̈ŋ në tɛ̈n cenë bead ya tek yiic në thɛɛr tɔ̈ nhial yiic kenë cells cïï bead ya tek yiic ku ka cï döŋ në pïu yiic. Kën ë thëm de gël de piath acï yök ke nɔŋ kë dït thöŋ në kaam de kee käŋ kaa rou (r = 0.77), ku thëm de thëm de thëm de 86 ë thëm de käŋ anɔŋ thëm dït de thëm (Thiɛ̈ŋ 2B). Ku na yïn ya, ke dhɔ̈l käkë alëu bïk käjuëc ye röt looi ya caath apath në cells yiic, ku kän ee dhöl tueeŋ yenë käjuëc ye röt looi në HGSC yic ya ŋic, ku kän ee kɔc cɔk ŋic käjuëc ye röt looi në cells yiic.
(A) Thura de kë cï looi de mägnëtïk bëad ënïrcïmätïön. Na ŋoot ke këc thëm në LC-MS/MS, ke kä cï röt looi abï ya tëëk në dhɔ̈l kaadiäk yiic ke thëm de pïu yiic ka bïk ya rëër në pïu yiic. (B) Kë ye yök në dhöl de pïïr yic në dït de kä ye röt looi yiic. Aciëŋ de thëm de käŋ kaadiäk tënë dhöl de pïïr ëbɛ̈n ± SE. Lany ë grey ee 1:1 ë määth nyuɔɔth. Määth de kä tɔ̈ në akutnhom yic (ICC) de thëm ye dhuɔ̈kpiny cï nyuɔɔth në kë yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ. NAD, nïkötïnämïd adënïn dïnyuklötäid. (C) Thura de thëm de luɔi de thëm de kä ye yök në raan tuaany yic. Ascites ka thɛ̈mthɛ̈m aye keek yök tënë kɔc tuany ku tɔ̈ɔ̈u keek në pïu yiic. Aciëŋ thiin de kë them acï caath në thëm de pïu, ku kä cï döŋ aacï keek looi në dhɔ̈l kaa diäk ke CD4+, CD8+ ku CD45-. Käk ë thëm ë thëm ë thëm ë LC-MS/MS. (D) Kë ye nyuɔɔth de atuɔ̈c de kä juëc ke kä ye röt waar yiic. Kë ye nyuɔɔth de tiim ee akutnhom de Ward nyuɔɔth de kaam de Euclidean në kaam de kä ye nyuɔɔth. (E) Käk dït ë thëm (PCA) de thëm de metabolite map, nyuɔɔth käŋ kaa diäk cï keek dhuɔ̈kpiny ke thëm tök, thëm tënë raan tuaany tök aye keek rek në thëm. (F) PCA de pïïr de metabolite de thëm cï tääu në raan tuaany yic (cïmën, luɔɔi de thëm de thëm cï tääu në thëm yic); thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm. PC1, kë dït ë 1; PC2, kë dït 2.
Në thɛɛr kɔ̈k yiic, ɣok acï dhöl de gɛ̈tgɛ̈t kënë luɔ̈ɔ̈i buk käŋ kaa 99 ke CD4 +, CD8 + ku CD45-cell ë tɛ̈ɛ̈k yic në thɛɛr tueŋ ke tɔ̈ɔ̈u ku tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u de kɔc tuany ke HGSC kaa dhetem (Thöŋ 2C, Thura S3A ku Thöŋ S3 ku S4). Ciin de kä kɔɔr keek ee 2% agut cï 70% de kä juëc thɛɛr ke kä pïr, ku ciin de kä ye wuɔ̈ɔ̈c apɛi në kaam de kɔc tuaany. Të cïnë käŋ tek yiic, ke bak de kë kɔɔr (CD4+, CD8+ wala CD45-) ee kä juëc awär 85% de kä pïr kedhie në kë cï them yic në thööŋ. Kueer de gɛ̈m de käŋ kënë ee ɣok puɔ̈l buk ciin de cells ya caath tënë tɔ̈c de raan, man cïï rot ye lëu bï ya looi në kä juëc cï kek them yiic. Në luɔɔi de ye lööŋ kënë yic, ɣok acï yök ke l-kynurenine ku adenosine, kee käŋ kaa rou cï keek ŋic apuɔth ke gël de guɔ̈p acï keek jat nhial në tɔ̈ɔ̈u de T wala tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u (Thiɛ̈ŋ S3, B ku C). Ku na yïn ya, ke kä cï kek yök ëtënë aye piath de käŋ nyuɔɔth ku jɔl ya tɛ̈n yenë käŋ tek yiic ku jɔl ya teknologï de mass spectrometry agonë ​​kä thiekiic ke pïïr ya yök në räl ke raan tuany yiic.
Kë cï ɣok tïŋ acï nyuɔɔth aya lɔn nɔŋ yen tɛ̈ɛ̈k ril de metabolic de dhɔ̈l ke cells yiic ku në kaam de kɔc tuany yiic (Thiɛ̈ŋ 2D ku Thura S4A). Në thɛɛr kɔ̈k yiic, të thööŋë yen ke kɔc kɔ̈k tuany, raan tuany 70 acï käk wääc ke pïïr nyuɔɔth (Thiɛ̈ŋ 2E ku Thura S4B), ye nyuɔɔth lɔn lëu bï naŋ kä juëc wääc ke pïïr ë kɔc tuany. Alëu bï ya ŋic lɔn nadë ke thööŋë kek kɔc tuany kɔ̈k (1.2 agut cï 2 lïtïr; Table S1), ke thööŋ de aciëŋ cï yök tënë raan tuany 70 (80 ml) ee tɔ̈ ke koor. Kuɛ̈ny de kä wääc ke kɔc tuany në thɛɛr ke thëm de kä dït (cïmën de, luɔɔi de thëm de kä juëc cï röt waar) ee kä ye röt waar nyuɔɔth në kaam de käke cell, ku käke cell ku/wɛ̈lɛ̈/ka ɣän thiik ke piny aye keek määt yiic apuɔth cït mɛn de käke metabolite (Thiɛ̈ŋ 2F ). Cɛɛth cï looi në metabolites tökic acï kee käkë bɛ̈n ya nyuɔɔth ku ka cï wuɔ̈ɔ̈c thiekic ya nyuɔɔth në kaam de cells ku jɔl ya piny thiin koor. Alëu bï ya ŋic ke kë dït apɛi wääc cï tïŋ ee MNA, man ye lac yök ke cï tääu në CD45- yic ku në CD4+ ku CD8+ yiic ye tɔ̈ në tɔ̈ɔ̈u yic (Thiɛ̈ŋ 3A). Tënë CD4 +, ke kën ee rot lac tïŋ, ku MNA tɔ̈ në CD8 + yic ëya dɛ̈t ee rot tïŋ ke ril yic apɛi në pinynhom. Ku na yïn ya, ke kën acie kë thiekic, rin ë kɔc tuany yiic kaadiäk ë kɔc tuany yiic ë dhïc yiic alëu bïk thëm ë CD8+ ë tumor. Në MNA yic, në dhɔ̈l wääc yiic ke mɛ̈c yiic në ascites ku mɛ̈c yiic, ke mɛ̈c kɔ̈k peei ye tɔ̈ në TIL yic aye tɔ̈ ke wääc ëyadɛ̈ (Thiɛ̈ŋ S3 ku S4). Ku na yïn ya, ke wël käkë aye käpath ye guöp cɔk ril yiic nyuɔɔth agonë ​​rïthäc ya looi.
(A) Kä cï röt looi ke MNA në CD4+, CD8+ ku CD45- yiic në pïu yiic ku pïu yiic. Kë cï gɔ̈t në thanduŋ yic ee kën ciɛɛl nyuɔɔth (thäm), kën tɔ̈u kam de käŋ kaa ŋuan (kë cï thuur) ku kën tɔ̈u në wël yiic, agut cï 1.5 në thɛɛr ke kën tɔ̈u kam de käŋ kaa ŋuan (kë cï thuur whisker). Cït mɛn cïnë ye lueel në Käk ë Raan tuany ku Dhöl ë luɔi, luɔ̈ɔ̈i ë limma ë raan tuany bï P ë ran tuany yök (*P<0.05 ku **P<0.01). (B) Thura de MNA ë tɛ̈ɛ̈k de käŋ (60). Mëtäblïtïs: S-ädënösïl-1-mëthïönïn; SAH, S-ädënösïn-1-hömöcïstïn; NA, nïkötïnämïd; MNA, 1-mëtïlnïkötïnämïdë; 2-PY, 1-mëthïl- 2-pïrïdön-5-kärböxämïdë; 4-PY, 1-mëthïl-4-pïrïdön-5-kärböxämïdë; NR, nïkötïnämïd rïbösë; NMN, nïkötïnämïd mönönukleötïd. Käk ë thɛ̈m (gërïn): NNMT, nïkötïnämïd N-mëthïltränsfëräsë; SIRT, käk ë thäät; NAMPT, nïkötïnämïd pöspörïbösïl tërfëräsë; AOX1, aldëhïdë öxïdës 1; NRK, nïkötïnämïd rïbösïdë kïnäsë; NMNAT, nïkötïnämïd mönö Nüklöötïd adënïlätë tränsëräsë; Pnp1, pïrïn nïuklösïd pöspörïläsë. (C) t-SNE de scRNA-sëq de pïu ë pïu (aciëŋ ë pïu) ku pïu ë pïu (aciëŋ ë pïu; n = 3 kɔc tuany). (D) NNMT ee rot nyuɔɔth në ciin de kä wääc yiic cï kek yök në luɔɔi de scRNA-seq. (E) Luɔɔi de NNMT ku AOX1 në SK-OV-3, rïŋ de raan (HEK) 293T, T ë mɛ̈th ku MNA-cï tɔ̈ɔ̈u në T ë mɛ̈th. Kë cï gɔ̈t acï nyuɔɔth ke thiääk keke SK-OV-3. Kë ye nyuɔɔth ke SEM acï nyuɔɔth (n = 6 kɔc ë pial guöp ë gɛ̈m). Ct thööŋ dït awär 35 aye yök ke cïï lëu bï yök (UD). (F) Luɔɔi de SLC22A1 ku SLC22A2 në SK-OV-3, HEK293T, T ë thäät ku T ë thäät cï keek tɔ̈ɔ̈u në 8mM MNA. Kë cï gɔ̈t acï nyuɔɔth ke thiääk keke SK-OV-3. Kë ye nyuɔɔth ke SEM acï nyuɔɔth (n = 6 kɔc ë pial guöp ë gɛ̈m). Ct thööŋ dït awär 35 aye yök ke cïï lëu bï yök (UD). (G) Kä tɔ̈ në MNA yic në T cells cï kek gäm kɔc cï pial yiic në thɛɛr kaa 72 cï kek tääu në MNA yic. Kë ye nyuɔɔth ke SEM acï nyuɔɔth (n = 4 kɔc ë pial guöp ë gɛ̈m).
MNA ee looi në gɛ̈ɛ̈r de akut de methyl tënë S-adenosyl-1-methionine (SAM) agut cï mɛ̈c (NA) në gɛ̈ɛ̈r de mɛ̈c (NNMT; Thura 3B). NNMT ee tɔ̈ ke cë yök në tuanytuɛɛny juëc ke kɔc yiic ku ka ye thiääk kenë dït de tuanytuɛɛny, dɔm de tuanytuɛɛny ku dït de tuanytuɛɛny ke tuanytuɛɛny (25-27). Ku bïk ŋic apɛi të bïï MNA thïn në T yiic në TME yic, ɣok acï scRNA-seq luɔ̈ɔ̈i buk NNMT nyuɔɔth në dhɔ̈l juëc yiic në pïu yiic ku pïu yiic në kɔc tuany ke HGSC kaadiäk (Table S5). Cɛɛth cï looi në kä cï kek thɔ̈ɔ̈ŋ ke 6,500 yiic acï nyuɔɔth ke tɔ̈ në ɣän ke ascites ku ɣän ke tɔ̈c yiic, ke NNMT ee rot gël tënë kä ye thɔ̈ɔ̈ŋ ke fibroblast ku tɔ̈c de tɔ̈c (Thiɛ̈ŋ 3, C ku D). Alëu bï ya ŋic ke cïn kë ŋic NNMT ye rot nyuɔɔth në gɛɛr de ciin de kɔc yiic ye PTPRC (CD45 +) nyuɔɔth (Thöŋ 3D ku Thura S5A), man ye nyuɔɔth ke MNA cï yök në thɛɛr ke tɔ̈c yiic acï tääu në T cells yiic. AOX1) ee MNA waar bï ya 1-mëthïl-2-pïrïdön-5-kärböxämïd (2-PYR) ka 1-mëthïl-4-pïrïdön-5-kärböxämïd (4- PYR); Thura 3B) ee tɔ̈ ke cï gël ëyadɛ̈ tënë ciin de fibroblasts ye COL1A1 nyuɔɔth (Thura S5A), man ye nyuɔɔth në tök ke T cells acïn riɛl de MNA thɛɛr. Tɛ̈n yenë kee kä thiääk kenë MNA käkë röt nyuɔɔth thïn acï yök në luɔɔi de wël ke rou ke nhomlääu cï keek looi tënë kɔc tuany ke HGSC (Thiɛ̈ŋ S5B; n = 6) (16). Në ye kënë yic, ke thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm (qPCR) de thëm de thëm de thëm de thëm de T cï looi në MNA acï nyuɔɔth lɔn nadë ke thööŋë kenë thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de SK-OV-3, NNMT ka AOX1 acï thiɔ̈k ke cïï rot ye nyuɔɔth (Thiɛ̈ŋ 3E). Kä cïï kek ye ŋɔ̈ɔ̈th ëke cï kek yök ëtënë aye nyuɔɔth ke MNA alëu bï ya nyaai tënë fibroblasts ka tumors ago ya lɔ në T cells thiääk kenë yen yiic në TME yic.
Na cɔk kɔc cï kek lɔc ya naŋ akut de kä ye käŋ ɣaac wei 1 agut cï 3 (OCT1, OCT2 ku OCT3) cï kek ya tääu në akut de kä ye käŋ ɣaac wei yiic (SLC22A1, SLC22A2 ku SLC22A3), ke kä lëu bïk MNA ya ɣaac wei aŋoot ëke këc kek ya guiir (28). QPCR de mRNA tënë T cells cï gäm kɔc piɔl acï nyuɔɔth ke tɔ̈u piiny ke SLC22A1 ku tɔ̈u ke cïï yök ke SLC22A2, cï yök ke cï lueel wënthɛɛr në athör yiic (Thiɛ̈ŋ 3F) (29). Në thööŋ, ke SK-OV-3 ë tɔ̈ në thɛɛr ke tɔ̈c yiic ee tɔ̈c dït apɛi nyuɔɔth në thɛɛr ke tɔ̈c yiic kedhiɛ (Thiɛ̈ŋ 3F).
Në thëm de thëm de T cells nɔŋ riɛl bïk MNA de bɛ̈i kɔ̈k peei ya lööm, ke T cells ke pial ë guöp cï kek ya tääu në thɛɛr kaa 72 yiic ke nɔŋ käjuëc wääc ke MNA. Na cïn MNA tɔ̈ aɣeer, ke kä tɔ̈ në MNA yic acïï lëu bï kek ya yök (Thoŋ 3G). Ku na yïn ya, ke T cells cï kek ya looi në MNA ë bɛ̈ɛ̈i kɔ̈k peei yiic, acï ya nyuɔɔth ke MNA tɔ̈ në cells yiic ee rot juak në thɛɛr juëc yiic, agut cï 6 mM MNA (Thoŋ 3G). Kë cï bɛ̈n bei kënë ee yen nyuɔɔth ke cɔk ya tɔ̈ ke cïn kë ye cɔl enzyme ye MNA cɔk lɔ tueŋ, ke TIL alëu bï MNA ya lööm.
Kä ye röt looi në T cells ke kɔc tuany yiic ku jɔl ya kä ye kek yök në vitro MNA yic aye MNA cɔk tɔ̈ apath (CAF) ku kä ye röt looi në tuanytuɛɛny yiic aye MNA cɔk tɔ̈ apath ku jɔl ya luɔɔi de TIL. Ku bï kë ye MNA looi ya ŋic në T cells yiic, ke T cells cï kek ya gäm kɔc ëke piɔl aake cï kek ya luɔɔi në vitro yic të nɔŋ yen MNA ka cïn yen, ku jɔl ya tɛ̈n ye kek röt juak thïn ku jɔl ya tɛ̈n yenë cytokine kek cak thïn aacï kek ya caath. Në nïn kaa 7 yiic ke MNA cï juak thïn në thëm dït yic, ke ciin de kɔc cï röt juak në thëm yic acï bɛ̈n dhuɔ̈kciëën, ku riɛl acï bɛ̈n ya muk në thëm ëbɛ̈n yic (Thiɛ̈ŋ 4A). Në ye kënë yic, ke töök de MNA ë tɔ̈ në bɛ̈i kɔ̈k peei yiic ee CD4 + ku CD8 + T ë tɔ̈ në thɛɛr ke tɔ̈c yiic juak (TNFα; Thura 4B). Në thööŋ, ke tɔ̈c de IFN-γ ee tɔ̈ ke cë thök në CD4 + T, ku ka cie CD8 + T, ku ka cïn kë dït cï rot waar në tɔ̈c de 2 (IL-2; Thura 4, C ku D). Ku na yïn ya, ke thëm de kä ye tɔ̈ në pïu yiic (ELISA) ke kä ye tɔ̈ në pïu yiic në kee kä cï kek looi në MNA yiic, acï TNFα juak rot apɛi, ku ka cï IFN-γ bɛ̈n dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n, ku ka cïn kë cï rot waar në IL-2 yic (Thöŋ de 4, E agut cï G). . Ku thök de IFN-γ ee yen nyuɔɔth ke MNA alëu bï naŋ kë ye looi në gël de kä ye tɔ̈ në T cells yiic. Në kë bïnë MNA ya thɔ̈ɔ̈ŋ në kä ye röt looi në T cell yiic, ke kä ye rim dɔm aye α ku CAR-T (GFP) mac në kä ye rim yök në rim yiic. Kä ke CAR-T aake ye kek mac në thɛɛr kaa 24 ke MNA tɔ̈ thïn, ku ka cï kek ya mac kenë kä ke raan cɔl SK-OV-3 ye kä ye lac yök në α yic ya nyuɔɔth në ciin de 10:1. MNA ë töök acï thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë FRα-CAR-T ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök (Thiɛ̈ŋ 4H).
(A) Ciin de cells ëbɛ̈n ë pïr ku ciin de kɔc ë rou (PD) ë thäät yiic tënë ciɛɛŋ në köl de 7. Bar graph ee thööŋ + SEM de kɔc ë pïr ë pïr kaa dhetem nyuɔɔth. E kä cï yök nyuɔɔth tën kä lik n = 3 käke nyooth lääu. (B agut cï D) CD3/CD28 ku IL-2 aacï keek luɔ̈ɔ̈i bïk T ë thäätken ë MNA ë thäät kaa 7 yiic. Tɛ̈ këc ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm, ë thëm ë thëm ë PMA/ionomycin ë GolgiStop ë thëm ë 4. TNFα (B) ë thäät ë T ë thäät. Thura ye nyuɔɔth (ciëën) ku wël cï kek gɔ̈t (ciëën) ke TNFα ye röt nyuɔɔth në kä pïr yiic. IFN-γ (C) ku IL-2 (D) ë thäät ë T ë thäät. Kë ye cɔl cytokines aye them në thëm de kä ye röt looi. Bar ë thëm ë thëm ë thëm (n = 6 kɔc ë pial guöp ë thëm) + SEM. Luɔ̈ɔ̈i ë dhöl töŋ de thëm de kä wääc ku thëm de dhukciëën (*P<0.05 ku **P<0.01) bï P yök. E kä cï yök nyuɔɔth tën kä lik n = 3 käke nyooth lääu. (E agut G) CD3/CD28 ku IL-2 aacï keek luɔ̈ɔ̈i bïk T ë thäätken ë MNA ë thäät kaa 7 yiic. Kë tɔ̈ ciɛɛl acï määt yiic ke thɛɛr ku thɛɛr ke 4 ke PMA/ionomycin ë thëm ë thëm. TNFα (E), IFN-γ (F) ku IL-2 (G) acï thëm ë ELISA. Bar ë thëm ë thëm ë thëm (n = 5 kɔc ë pial guöp ë thëm) + SEM. P thööŋ aye yök ke luui ë dhöl töŋ de thööŋ de kä wääc ku dhukciëën de thëm (*P<0.05). Lany cï gɔ̈t ee thök de yök de yök nyuɔɔth. (H) Athëmë lïsïs cëlläl. FRα-CAR-T wala GFP-CAR-T ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät (Ctrl). Aciëŋ de SK-OV-3 cï nɔ̈k acï them. P thööŋ ë thëm ë Welch t (*P<0.5 ku **P<0.01).
Në kë bïnë lööŋ ke TNFα ye tɔ̈ në MNA yic ya deetic apath, ke käjuëc ye röt geer në TNFα mRNA de T cells cï kek ya looi në MNA yic aacï kek ya caath (Thoŋ 5A). T cells cï kek ya gäm MNA aye röt juak në door yiic kaarou në TNFα yic, ku kän ee yen nyuɔɔth ke MNA ee rot gɛɛi në lööŋ ke TNFα yiic. Ku bï dhöl lëu benë ye lööŋ käkë ya thiëëc ya thiëëc, ke käŋ kaarou ŋic kek ye TNFα mac, man ye kek cɔl T cell nuclear (NFAT) ku jɔl ya mïïth kɔ̈k peei (Sp1), acï kek ya caath në dhuŋnhom de MNA ye rot rek kenë raan ye TNFα cɔk loi rot ( 30 ). Kë ye TNFα gël anɔŋic ɣän ke NFAT cï keek yök kaa 6 ku ɣän ke Sp1 kaa 2, ye röt mat në ɣän tök [-55 ke tɔ̈u në thɛɛr kaa rou (bp) tënë 5'cap] (30). Aciëŋ de ChIP ee yen nyuɔɔth ke të cenë yen ya töök në MNA, ke tɔ̈c de Sp1 kenë TNFα ee rot juak në door yiic kaadiäk. Tɛ̈u ë NFAT thïn ëya dɛ̈t acï rot juak ku thiääk ke kë thiekic (Thiɛ̈ŋ 5B). Kä cï kek yök ëtënë aye nyuɔɔth ke MNA ee luɔɔi de TNFα mac në luɔɔi de Sp1 yic, ku në dhöl thiin koor yic, ke NFAT ee luɔɔi de NFAT mac.
(A) Të thööŋë yen kenë T cï cil ke cïn MNA, ke gɛ̈ɛ̈r de TNFα ee rot waar në T cï looi në MNA. Kë ye nyuɔɔth ke SEM acï nyuɔɔth (n = 5 kɔc ë pial guöp ë gɛ̈m). E kä cï yök nyuɔɔth tën kä lik n = 3 käke nyooth lääu. (B) TNFα ë gɛ̈tgɛ̈t ë T ë tɔ̈ɔ̈u ë 8 mM MNA ë NFAT ku Sp1 cï keek mat yiic ke (Ctrl) ku PMA/ionomycin ë gɛ̈tgɛ̈t ë thɛɛr kaa 4. Kä ye guɔ̈p gël në guɔ̈p yic G (IgG) ku H3 aake ye kek luɔ̈ɔ̈i ke ye kä rac ku käpath yenë guöp gël në tuanytuɛɛny yiic, në tök. Cïm de ChIP acï nyuɔɔth ke mɛ̈ɛ̈t de Sp1 ku NFAT tënë raan ye TNFα cɔk loi rot në MNA-cï tɔ̈ɔ̈u yic acï rot juak në thɛɛr juëc yiic të thööŋë yen kenë tɔ̈ɔ̈u. E kä cï yök nyuɔɔth tën kä lik n = 3 käke nyooth lääu. P thööŋ ë thööŋ ë t-thëm juëc (*** P <0.01). (C) Të thööŋë yen ke aciëth de HGSC, ke T cells (cïn ë pïu ë pïu yiic) acï TNF dït apɛi nyuɔɔth në pïu yiic. Käk ë tɔ̈ thïn aye kɔc tuany wääc nyuɔɔth. Kä cï keek nyuɔɔth aacï keek thɔ̈ɔ̈ŋ ë ke wääc yiic agut cï 300 ku cï keek riɔ̈ɔ̈c bïk kä juëc cï keek thuur cɔk thök (** Padj = 0.0076). (D) Kë cï lueel de MNA tënë tuaany de nhom. MNA ee cak në käm yiic ku käm yiic në TME yic ku ka ye lööm në käm yiic ke T. MNA ee Sp1 juak tënë raan ye TNFα cɔk loi rot, ku kän ee TNFα cɔk juak rot ku bï TNFα ya cak. MNA ee IFN-γ cɔk tɔ̈ piiny ëyadɛ̈. Kuɛ̈nybei de luɔɔi de T cell ee thök de nɔ̈k cɔk tɔ̈ piiny ku bï dït de tumor lac looi.
Cït tɛ̈n cenë ye lueel thïn në wël cï kek lueel yiic, ke TNFα anɔŋ nhom tueeŋ ku nhom ciëën ye tɔ̈ në nhom ku nhom ciëën, ku ka nɔŋ kë ŋic apɛi në gël de nhom ku gël de nhom (31-33). Cït tɛ̈n cenë ye lueel thïn në wël cï kek lueel yiic, ke tɔ̈c de TNFα në acites ku tɔ̈c de kɔc tuany ë nhom ee dït apɛi awär tɔ̈c de nhom (34-36). Në thɛɛr ke luɔi, TNFα alëu bï tɔ̈c, luɔi ku dït de rim ɣer ya gël, ku ye tɔ̈c de rim ɣer waar (37, 38). Cït mɛn de kä cï kek yök käkë, ke thööŋ de kä wääc ke genes acï nyuɔɔth ke TNF ee tɔ̈ ke cï tääu nhial në T cells yiic në räl ke tumor yiic të thööŋë kek kenë ascites (Thoŋ 5C). Ku juɛ̈k-juɛ̈k de TNF ee rot nyuɔɔth në ciin de T cell yic kenë kä cïï thöŋ kenë kä ye kɔc nɔ̈k (Thiɛ̈ŋ S5A). Në mäny yic, ke wël käkë aye wɛ̈t ye lueel ke MNA anɔŋ käŋ kaarou ye guöp cɔk ril ku ye tumor cɔk loi rot në HGSC yic.
Tɛ̈ yenë käŋ tääu në pïu yiic në kë yenë käŋ cath në pïu yiic, acï bɛ̈n ya dhöl tueeŋ yenë TIL puɔ̈ɔ̈c në tɛ̈n yenë käŋ röt waar thïn. Kä cï kek kueen käkë acïk nyuɔɔth lɔn nadë ke thööŋë kenë rim ke rim ke rim ka T cells ke rim ke rim ke rou, TIL de murine ku raan anɔŋ dhöl dït apɛi ye glucose dɔm (4, 39) ku thök de luɔɔi de rim ë nhom (19, 40). Na cɔk ya tɔ̈ ke ɣok cï kä thöŋ kenë kä cï kek yök në ye puɔ̈ɔ̈c kënë yic ya tïŋ, ke kë tueeŋ ëcï rot looi ee bï mïïth ya thɔ̈ɔ̈ŋ në thɛɛr ke tɔ̈c yiic ku jɔl ya TIL tënë thɛɛr thöŋ ke tɔ̈c cï kek tɔ̈ɔ̈u yiic. Cït mɛn de kä kɔ̈k cï ke lueel wënthɛɛr, mɛ̈c (CD45-EpCAM +) ë mɛ̈c ë nhom ku mɛ̈c ë mɛ̈c anɔŋ mɛ̈c juëc ë mɛ̈c ë mɛ̈c ë CD8 + ku CD4 + T, ku ye kuɔɔny lɔn ye mɛ̈c ë mɛ̈c ë mɛ̈c ë mɛ̈c dït apɛi thɔ̈ɔ̈ŋ ke mɛ̈c ë nhom. Kë ye tak de mëën de T cell. TME. Ku na yïn ya, ke luɔɔi de mɛ̈c ë nhom ee dït apɛi awär luɔɔi de CD8 + T, ku luɔɔi de mɛ̈c ë nhom ee thöŋ ke luɔɔi de CD4 + T. Kä cï bɛ̈n bei kënë aye wɛ̈t cï bɛ̈n nhial cɔk ril yic lɔnadɛ̈ ke mɛ̈c de mɛ̈c ee kë thiekic tënë mɛ̈c ke mɛ̈c (41, 42). Aye lueel ëyadɛ̈ ke CD8 + T aalëu bïk ya tɔ̈ ke cïn kë ye kek gël në CD4 + T, ka CD4 + T aalëu bïk ya luui në dhɔ̈l kɔ̈k peei ke glucose agokë luɔɔiden ya muk apath (43, 44). Alëu bï ya ŋic ke ɣok acïn wuɔ̈ɔ̈c cï tïŋ në glucose ë dɔm yic ka luɔɔi de miök ë nhom në kaam de CD4 + T ë nhom, T ë nhom ë nhom ku T ë nhom ë nhom ciɛɛl ë nhom ë nhom. Cïmën de, wuɔ̈ɔ̈c de CD8 + T në tɔ̈ɔ̈u yic acïn kë ye looi kenë gɛ̈ɛ̈r de glucose, ku ye wuɔ̈ɔ̈c thiekic nyuɔɔth në kaam de T cï cak në vitro yic ku TIL de raan në vivo yic (22). Kä cï kek tïŋ käkë aacï kek bɛ̈n gam ëyadɛ̈ në luɔɔi de tɛ̈ɛ̈k de ciin de käm cï röt looi yetök, man cï bɛ̈n ya nyuɔɔth ke CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + käm nɔŋ glucose dït apɛi ye kek lööm ku yekë luui në käm yiic awär ciin de käm yiic. Ciin de kɔc käkë alëu bï ya tɔ̈ ke ye ciin de kä ye guöp cɔk ril ka kä ye guöp cɔk ril yiic cï kek ya yök në cRNA-seq yic. Na cɔk kee käkë kedhiɛ ya tɔ̈ ke cï kek ya lueel në thɛɛr ke tɔ̈c ke raan yiic [45], ke ka ŋoot ëke wïc bïk luɔɔi dɛ̈t peei ya looi agokë tɔ̈c de myeloid kënë ya guiir.
Na cɔk ya tɔ̈ ke dhɔ̈l yenëke pïu cath në pïu yiic ya lëu bïk wuɔ̈ɔ̈c de glucose ku jɔl ya tɛ̈n yenë käŋ röt waar në kaam de cells yiic ya guiir, ke tɛ̈n yenë glucose ka kä kɔ̈k peei yenë carbon yök thïn në TME yic akëc kek kɔn ya ŋic. Tɛ̈ bïnë TIL tɔ̈ thïn ya tɔ̈ ka cïn yen tɔ̈ thïn, ke ka wïc bï ciin de cell ya cɔ̈kpiny në räl cï kek nyaai yiic. Ku na yïn ya, ke dhöl yenë käŋ cɔk dït apɛi cï mat kenë mass spectrometry alëu bï kɔc ya nyuɔ̈th käjuëc ye röt looi në T cells yiic ku jɔl ya ciin de tumor në thöŋ de kä cï kek yök në kɔc tuany yiic. Na cɔk dhöl kënë ya naŋ käpath tɔ̈ kenë kek në tɛ̈ɛ̈k de käŋ yiic, ke ɣän kɔ̈k ke metabolite alëu bïk ya riääk në kë de tɔ̈cden ku/ka tɛ̈n yenë kek lac waar yiic (22). Ku na yïn ya, ke dhölda acï käŋ kaarou ŋic kek ye kɔc gël në tuanytuɛɛny yiic, cɔl adenosine ku kynurenine, në kë ye kek wuɔ̈ɔ̈c apɛi në kaam de kä cï kek them yiic.
Cɛɛth de kä ye röt looi në thɛɛr ke tɔ̈c ku TIL yiic ee käjuëc ke luɔɔi de kä ye röt looi në TME de tɔ̈c yic bɛ̈i. Kë tueŋ, në luɔɔi de thëm de pïu ë pïu yiic, ɣok acï yök ke cïn kë wääc në luɔɔi de pïu yiic në kaam de pïu yiic ku CD4 + T cells. Ku na yïn ya, ke thëm de LC-MS/MS acï käjuëc cï röt waar në käjuëc ye röt waar yiic në kee akuɔ̈tnhïïm käkë yiic bɛ̈n nyuɔɔth, ku ye nyuɔɔth ke wël cï kek lueel në kë de TIL ku jɔl ya luɔɔiden ëbɛ̈n aye wïc bï kek ya guiir apath. Kë de rou, MNA ee kë ye tɔ̈ në pïu yiic ku nɔŋ wuɔ̈ɔ̈c dït apɛi në kaam de CD45-cells ku T cells në pïu yiic, ke cie pïu yiic. Ku na yïn ya, ke tɛ̈n yenë käŋ tek yiic ku jɔl ya të tɔ̈në tumor thïn alëu bï ya naŋ käjuëc wääc ye röt looi në TIL metabolism yic, man ye käjuëc wääc ya nyuɔɔth në ɣän thi kɔ̈k yiic. Kë de diäk, ee luɔɔi de MNA-ye enzyme NNMT nyuɔɔth ee rot lac looi tënë CAF, man ye ya cells ke tumor në thɛɛr lik yiic, ku kä ye yök ke MNA aye kek tïŋ në cells ke T yiic. Tɛ̈ yenë NNMT rot juak thïn në CAF de tɔ̈c yic anɔŋ kë nyic ke ye tuanytuɛɛny ke cancer cɔk loi rot, në biäk de tɔ̈c de CAF, tɔ̈c de tumor ku tɔ̈c de tɔ̈c (27). Na cɔk tɔ̈ ke thök de TIL ëbɛ̈n ya tɔ̈ ciɛɛl, ke thööŋ de NNMT në CAF yic ee thiääk kenë thök de thök de thök de thök (TCGA), man ye thiääk kenë thök de thök ë thök (27, 46, 47). Në thök, ke luɔɔi de enzyme AOX1 ye MNA riɔ̈ɔ̈k ee tɔ̈ ëyadɛ̈ ke ye kë thiin koor tënë ciin de CAF, man ye nyuɔɔth ke T cells acïn riɛl bïk MNA ya waar. Kä cï kek yök ëtënë aye wɛ̈t kän kuɔɔny në kë cenë luɔɔi dɛ̈t peei ya wïc agonë ​​kä cï kek yök ya ŋic, ke MNA dït apɛi në T cells yiic alëu bï ya nyuɔɔth ke nɔŋ kë ye guöp gël në tuanytuɛɛny ke CAF.
Në kë cenë MNA ye cath ya tɔ̈ piiny ku jɔl ya mïïth cïï kek ye lac yök në MNA yic, ke tän de MNA në T cells yiic ee kë cïï ŋic. Ke NNMT ka AOX1 acïï lëu bï kek ya yök në cɛɛth de scRNA-seq ku qPCR cï tääu në akuɔ̈tnhïïm kaarou yiic. Kä cï kek yök ëtënë aye nyuɔɔth ke MNA acie looi në T cells, ku ka ye lööm në TME thiääk kenë yen. Kä cï kek ya them në vitro yic aye nyuɔɔth ke T cells aye röt määt në MNA yic.
Kuɛ̈n cï looi në vitro yic acï nyuɔɔth ke MNA ye tɔ̈ në biäk de aɣeer ee TNFα cɔk loi rot në T cells yiic ku ye Sp1 cɔk tɔ̈ kenë raan ye TNFα cɔk loi rot. Na cɔk TNFα ya naŋ luɔɔi ë gël de tuanytuɛɛny ku gël de tuanytuɛɛny, ke tuanytuɛɛny ke nhom, ke TNFα alëu bï dït de tuanytuɛɛny ke nhom ya cɔk dït (31-33). Kuɛ̈nybei de TNFα në ciɛɛŋ de tɔ̈c de tɔ̈c yic ka tɔ̈c de TNFα në tɔ̈c de tɔ̈c yic në tɔ̈c de tɔ̈c yic alëu bï TNFα-ye tɔ̈ në thɛɛr ke tɔ̈c yiic ya cɔk loi rot ku bï dït de tɔ̈c ya gël (32, 35). Ku na yïn ya, ke tɔ̈ në ye wɛ̈t kënë yic, ke MNA cï bɛ̈n bei në TME yic alëu bï ya luui cït mɛn de kën ye guöp cɔk ril në TNFα yic në dhöl yenë tuanytuɛɛny ke nhom cɔk tɔ̈ ku bï ya thiäi piny (31). Cït mɛn de kë lëu bï rot looi, TNFα gël aye kueen ke ye kën lëu bï ya töök tënë tuaany de nhom (37, 48, 49). Në yekënë nhom, ke MNA ee käm ke CAR-T ya riɔ̈ɔ̈kic tënë käm ye tɔ̈ në adhiëëth yiic, ku ye kä kɔ̈k peei ye yith nyuɔɔth në kë yenë MNA gël në käm yiic. Në mät yic, ke kä cï kek yök ëtënë aye jam në kë yenë tumors ku jɔl ya CAF cells MNA ya nyaai në TME yic. Në (i) TNF-cït ë dït de tuaany de nhom ku (ii) MNA-cït T cell ë thɛ̈mthɛ̈m ë thɛ̈mthɛ̈m, kën alëu bï naŋ käŋ kaa rou ke thɛ̈mthɛ̈m (Thiɛ̈ŋ 5D).
Në thökde yic, në luɔɔi de mɛ̈ɛ̈t de kä ye röt lac looi në thɛɛr juëc yiic, tɛ̈ɛ̈k de kä ye röt lac looi ku tɛ̈ɛ̈u de kä ye röt looi në thɛɛr yiic, ke puɔ̈ɔ̈c kënë acï wuɔ̈ɔ̈c dït apɛi de kä ye röt looi në kaam de kä ye röt lac looi në kɔc tuany ke HGSC yiic nyuɔɔth. Cɛɛth cï looi acï yen bɛ̈n nyuɔɔth ke nɔŋ wuɔ̈ɔ̈c në tɛ̈n yenë glucose lööm thïn ku jɔl ya luɔɔi de mitochondrial në kaam de T cells yiic, ku ka cï MNA ya yök ke ye kë cïï tɔ̈ ke ye rot mac yetök. Kä cï kek yök käkë aanɔŋ kë yekë looi në tɛ̈n yenë TME T cells yök thïn në tuanytuɛɛny ke raan yiic. Na cɔk mëën de mïïth ya tɔ̈ në kaam de T cells kenë cells ke cancer ya tɔ̈ ke cï ya lueel, ke metabolites alëu bïk ya luui ëyadɛ̈ agonë ​​tumor ya cɔk lɔ tueŋ apath ku bïk kä ye guöp cɔk ril ya gël. Luɛɛl dɛ̈t peei yenë luɔɔi de kee metabolites käkë ya guiir alëu bï dhɔ̈l kɔ̈k peei ya liep agonë ​​tuanytuɛɛny ya cɔk ril.
Kä cï kek yök ke kɔc tuany ku wël ke paanakïm aake cï kek ya yök në ɣän ke tɔ̈ɔ̈u ke tuanytuɛɛny ke BC cï kek ya gam në akut de tɔ̈ɔ̈u de tuanytuɛɛny ke Canada. Cït mɛn cenë ye lueel në lööŋ cï kek gam në Akutnhom de Käke Luɔɔi de Kɔc tuany ku jɔl ya Jamya de Kɔc ke Tɔŋ (H07-00463), kä cï kek yök ke kɔc tuany kedhiɛ ku wël ke paanakïm acï kek bɛ̈n yök ke cï kek gɔ̈t në athöör cï kek gam yiic ka cïk lööŋken puɔ̈l. Käk them aaye keek tɔ̈ɔ̈u në BioBank cï gam yic (BRC-00290). Käk ë thööŋ ë raan tuany acï nyuɔɔth në Tables S1 ku S5. Në këde tɔ̈ɔ̈u de käŋ në pïu yiic, ke kë ye cɔl scalpel aye luɔ̈ɔ̈i bïnë kë cï yök në raan tuaany yic rac ku jal tääu në kë ye käŋ dhiim yic ye 100-micron looi bï kë töŋ cï tääu thïn yök. Aciëŋ de raan tuany acï tääu në 1500 rpm yic në minit ka 10 në 4°C bï pïu ë pïu yiic ya tääu në pïu yiic ku bï pïu ë pïu yiic ya nyaai. Kä cï kek yök në tɔ̈ɔ̈k yic ku jɔl ya kä cï kek yök në pïu yiic aake cï kek ya tɔ̈ɔ̈u në ciin de 50% de AB serum (Sigma-Aldrich), 40% de RPMI-1640 (Kë ye yök në pïu yiic) ku jɔl ya 10% de pïu yiic. Kä cï kek tɔ̈ɔ̈u ke cell tök aake cï kek ya tääu në pïu yiic ku ka ye kek luɔ̈ɔ̈i në kä ye kek cam yiic ku jɔl ya kä ye kek cam yiic cï kek kiɛ̈ɛ̈t piiny ëtënë.
Kë cï thöl ë luɔi anɔŋic 0.22 μm cï juiir 50:50 cï juak thïn RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thërmö Pïshër Scientïfic) acï juak thïn kenë 10% de atuɔ̈c-cïï luui ë AB ë raan (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hëpës (Thërmö Pïshër Sïcïënt), 2 mM l-glütaminë (Thërmö Pïshër Sïcïënt). Kë ye yök në pïu yiic (Thërmö Fisher Scientific) ku 50 μMB-merkaptöëthanöl. AimV (Kë ye yök në pïu yiic) aye juak në 20 mM de Hepës (Kë ye yök në pïu yiic) ku 2 mM l-glutamine (Kë ye pïu dɔm në pïu yiic). Kë ye pïu cɔk cath ee yic naŋ 0.22μm cï juiir në pïu yiic (PBS; Invitrogen) cï juak thïn kenë 3% de AB ye pïu cɔk tɔ̈u në mac yic (Sigma). Kë yenë käŋ cɔk ril yiic ee 0.22μm de PBS cï juiir ku cï juak thïn në 0.5% de AB ë raan cïn kë ye looi në atuɔ̈c yic (Sigma-Aldrich).
Në 37°C cï thök ë thëm, kä cï thök ë thëm acï keek tääu në 10 nM MT DR ku 100 μM 2-NBDG në minit kaa 30. Në ye cök ciëën kënë yic, ke kä cï kek tääu në ye guɔ̈p aacï kek ya tääu në pïu yiic ke eF506 në 4°C në minit ka 15 yiic. Tääu ë kä cï röt looi në FC Block yic (eBioscience) ku tɛ̈ɛ̈u ë kä cï röt looi në pïu yiic (cït mɛn cïnë raan ë loi yeen ye lueel), ku tääu ë keek në minit kaa 10 në atuɔ̈c de ɣöt yic. Tääu ë kä ye guɔ̈p gël në kä ye guɔ̈p gël (Table S2) në pïu yiic në 4°C në minit kaa 20 yiic. Tääu ë käm yiic në pïu yiic (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R) ke këc käŋ kɔn caath. Luɔ̈ɔ̈i ë SpectroFlo ku FlowJo V10 bï wël ë thööŋ ë cell thɔ̈ɔ̈ŋ, ku luɔ̈ɔ̈i ë GraphPad Prism 8 bï wël ë thööŋ cak. Kë tɔ̈u ciɛɛl de pïu ë pïu yiic (MFI) de 2-NBDG ku MT DR acï tääu-thöŋ, ku thëm de t cï mat acï luɔ̈ɔ̈i ke ye kën ë thëm de kä cï keek yök bï kɔc tuaany thöŋ yök. Tääu ë ciin de kɔc kedhiɛ nɔŋ kä lik ke 40 ke kä cï röt looi në thëm de käŋ yiic; tääu ë MFI thööŋ de 1 tënë gɛɛr de thööŋ cie yic ke yïn këc thööŋ de thööŋ de thööŋ ku thööŋ de kä cï yök looi.
Në kë bïnë dhöl de gël de ɣöt thok ya juak thïn në akut de ajuɛɛr tɔ̈ nhial yic, ɣok acï wël cï kek gɔ̈t kedhiɛ ya luɔ̈ɔ̈i në tim de gël de thura (FAUST) (21) agonë ​​cells ya tääu në ciin de kɔc yiic të cenë cells cï thou nyaai në FlowJo yic. Wɔ ye kä ye bɛ̈n bei thïn mac në kɔc cin agoku ciin de kɔc ye tïŋ ke cï keek tɛkpiny mat yiic (bï PD1+ mat kenë PD1-tumor cells) ku bï ciin de kɔc ya muk. Töŋ de kä cï them anɔŋic thööŋ de kä juëc awär 2% de cells, tënë ciin de kɔc kaa 11.
Kë ye cɔl Ficoll ë thëm de thëm de thëm acï luɔ̈ɔ̈i bï PBMC tek thook tënë kä ye rim tek thook (Tëknologï de STEMCELL). CD8 + T cells aacï keek nyaai tënë PBMC në luɔɔi de CD8 MicroBeads (Miltenyi) ku juakkë keek në dhöl cï thöl në luɔɔi de TransAct (Miltenyi) në wiik kaa 2 cït mɛn cïnë raan ë loi yeen ye lueel. Käk cï kek puɔ̈l bïk kɔ̈ɔ̈c në nïn ka 5 yiic në pïu cï thök yiic nɔŋic IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ku ka cï kek bɛɛr tääu në TransAct yic. Në kööl de 7, cït tɛ̈n cenë ye lueel thïn në kɔc ëke cak yen, ke CD45 MicroBeads (Miltenyi) ke raan acï kek bɛ̈n ya tääu në dhöl yic në thɛɛr kaadiäk yiic. Kä cï kek yök aacï kek ya tek yiic në thëm de thëm de thëm de thëm (cït man cenë ye lueel nhial), ku kä cï kek yök në thëm de LC-MS/MS yic aake cï kek ya tɛ̈ɛ̈k yiic në door yiic kaadiäk. Kä cï keek them aacï keek looi në LC-MS/MS cït mɛn cïnë keek lueel piiny ëtënë. Acuk thɔ̈ɔ̈ŋ ke kë cï määr de kä ye röt waar kenë namba de ion ye 1,000. Aye kë them abɛ̈n aye thɔ̈ɔ̈ŋ ke nambaai ke ion (TIC), ye keek waar ku ye keek thɔ̈ɔ̈ŋ yetök ë MetaboAnalystR ke këc laac yic.
Töŋ de cell cï tääu në raan tuaany tökic acï tääu në pïu yiic ku thëm në 40 μm thëm yic në kë cï thöl (cït mɛn cïnë ye lueel nhial). Cï të cenë ye luɛɛl thïn në lööŋ ke kɔc ëke cak kek yiic, ke käŋ kaadiäk cï kek ya kuanycök në tɛ̈ɛ̈k de käŋ yiic në luɔɔi de kä thi kɔ̈k peei (Miltenyi) acï kek bɛ̈n ya looi agonë ​​kä cï kek yök ke CD8+, CD4+ ku jɔl ya CD45- (në pïu yiic ya cɔk dït). Në wël lik yiic, ke cells aye kek bɛɛr tääu në cells yiic (cïmën cenë ye lueel nhial ëtënë) ku ka ye kek kueen. Kä cï kek yök aake cï kek ya tääu në CD8 de raan yic, CD4 de raan yic ka CD45 de raan yic (Miltenyi) në 4°C në minit ka 15 yiic, ku ka cï kek ya lɔ waak në kë yenë käŋ cɔk ril yiic. Kë cï them aye tëëk në thëm de LS (Miltenyi), ku thëm de thëm puɔth ku thëm rac aye keek määt yiic. Na wïc bï thɛɛr lik ya tekic ku bï dhöl benë cell ya dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n ya juak, ke CD8-acï ya luui në dhöl de rou de CD4+, ku CD4-acï ya luui në CD45-cic në thɛɛr kɔ̈k yiic. Tääu ë kë cï yök në pïu yiic në thɛɛr ke tɛ̈k-tɛ̈k yiic.
Acän ba kä ye them looi bïnë ke kä ye röt waar tïŋ, kä cï röt looi aacï keek lɔɔkic naa tök në awai lir, ku 1 ml de 80% de methanol acï mat tën kë them abɛ̈n, ku jal keek tääu në pïu yiic ku tɛ̈ɛ̈ukë keek në pïu yiic. Kä cï them aacï keek tääu në käŋ kaa diäk ke thök-liɛɛr ku tɛ̈ɛ̈uë keek në 14,000 rpm në minit kaa 15 në 4°C. Kë tɔ̈ në pïu yiic nɔŋic kä ye röt looi në pïu yiic ee rot tääu në pïu yiic agut cï bï riɛl. Kä ye röt waar yiic aacï kek bɛɛr tääu në 50 μl de 0.03% de acid yic, ku ka cï kek bɛ̈n liääp, ku ka cï kek bɛ̈n tääu në pïu yiic ago kä cï riääk ya nyaai.
Tääu ë käŋ bei cït mɛn cïnë keek lueel nhial. Tuɔɔc kë tɔ̈u nhial tënë biäk de pïu dït ye luui apuɔth tënë rïthäc de kä ye röt looi në pïu yiic. Luɔ̈ɔ̈i ë dhöl ë töök ë ran ëbɛ̈n bï thëm ëbɛ̈n töök kenë nambaa thöŋ ke cells bï kä rɛc ë batch gël. Wek aacï thëm de käke pinynhom ëbɛ̈n looi cï keek gɔ̈t wënthɛɛr në AB SCIEX QTRAP 5500 ë thëm de käŋ kaa diäk (50). Cɛɛth de kä ye tïŋ ku mɛ̈ɛ̈t de ɣän tɔ̈u nhial aacï keek looi në luɔɔi de kä juëc ke 2.1 käke luɔi (Kë cï Luɔɔi de Käke Piir ke SCIEX).
Kuɛ̈n de ion de 1000 acï luɔ̈ɔ̈i bïnë thööŋ de kë cï määr thɔ̈ɔ̈ŋ, ku TIC de kë them abɛ̈n acï luɔ̈ɔ̈i bïnë të tɔ̈u nhial de kë cï yök yök yup bï kä cï röt waar cɔk tɔ̈u apuɔth cï bɛ̈i në kën yenë käŋ tïŋ tën luɔi de kë them. Të cïnë TIC thɔ̈ɔ̈ŋ, kën ye käŋ tïŋ R(51) (kë tɔ̈u thïn) aye luɔ̈ɔ̈i tën wɛ̈ɛ̈r de nambaai ku thëm de thäm ye rot looi yetök. Wek aacï PCA luɔ̈ɔ̈i kenë vegan R package bïk thëm de kä wääc ke metabolome looi në kaam de kä ye nyuɔɔth, ku luuiku thëm de kä cï döŋ piny bï kɔc tuaany tïŋ. Luɔ̈ɔ̈i kueer de Ward bï kë ye nyuɔɔth de atuɔ̈c looi bï kaam de Euclidean mat në kaam de kä ye nyuɔɔth. Wɔ cï limma (52) luɔ̈ɔ̈i në käjuëc ye röt looi yiic ago käjuëc wääc ya ŋic në cell yiic kedhiɛ ku jɔl ya ɣän thii kɔ̈k peei yiic. Në kë bïnë kë cï lueel cɔk kɔ̈c yic, ɣok aye akutnhom de mean parameter luɔ̈ɔ̈i bï kë cï looi nyuɔɔth, ku yökku käke cell tɔ̈u në piny thiin koor yic cït mɛn de akutnhom tök (n = akutnhïïm kaa 6); në thëm de kë thiekic, ɣok acï thëm de thëm cï dhuɔ̈kpiny kaadiäk looi tënë metabolite tök Ku bï thëm de lueth gël, raan tuaany acï mat thïn ke ye kë ye kɔc gël në luɔɔi de limma yic. Në kë bï ɣok wuɔ̈ɔ̈c de metabolites ya tïŋ në kaam de kɔc tuany wääc yiic, ɣok acï limma model ya cɔ̈kpiny agut cï kɔc tuany në dhöl cï tääu. We acï kë thiekic de thööŋ cï lueel wënthɛɛr lueel në kaam de nuɔɔr de käke guɔ̈p ku piny thiin de Padj <0.05 (cökpiny de Benjamini-Hochberg).
Të cïnë riɛl dït yök në luɔɔi de kë yenë kä cï thou ke Miltenyi nyaai (>80% de pïïr), ke tɛ̈ɛ̈k de kä cï thou ke kä cï röt gɔ̈t acï looi në kä cï röt tääu në pïu yiic ku kä cï kek yök ke tumor në luɔɔi de 10x 5′gene yenë käŋ lueel. Käŋ kaa dhiëc keke kä thöŋ ke tumor ku ascites aacï keek caath, naa cak tɔ̈u ke tɔ̈u piiny tënë kën töŋ de tumor cï gël bï mat thïn. Në kë bïnë kɔc juëc cï kek lɔc ya yök, ɣok acï kä cï kek yök ke raan tök ya mat në dhɔ̈l ke 10x chromium gël yiic, ku thëmku ɣän ke ascites ku ɣän ke tumor në dhɔ̈l wääc yiic. Të cïnë thök ë thök ë thök [Illümïna HiSëq 4000 28×98 bp ë thök ë thök (PE), thök ë thök ë Quebec; thööŋ de 73,488 ku 41,378 kuen në räl tökic tënë tɔ̈ɔ̈k ku tɔ̈ɔ̈k ë pïu ë thäät yiic]], ɣok aacï CellSNP ku Vireo (53) luɔ̈ɔ̈i cït mɛn de SNP de raan ëbɛ̈n (VCF) cï bɛ̈i në GRChBS ee gäm kë ye raan tuaany gäm. (IBS), ke cïn kä cï keek tääu thïn ku kä cï keek ŋic ke ye kä cï röt mat ku kä cï keek gaam thöŋ në kaam de kä cï keek yök ke thɛ̈mthɛ̈m ku kä cï keek yök ke thɛ̈mthɛ̈m (54), ɣok acï käŋ kaa diäk muk keke thɛ̈mthɛ̈m juëc tɔ̈u në thɛ̈mthɛ̈m yic ku thɛ̈mthɛ̈m bï keek thɔ̈ɔ̈ŋ piny (Sc5o) acï käŋ kaa 6975 bɛ̈i (2792 ku käŋ kaa 4183 tënë tumor ku ascites, në tök) bï keek caath. ku ye tïŋ ke nɔŋ t-SNE ye tɔ̈ në CD8A ku GZMA yic, ke cïn akuɔ̈tnhïïm thii kɔ̈k nɔŋ kä thii cï kek gɔ̈t në Izar et al (16) yiic, agut cï t-SNE tɔ̈ kenë kek, alëu bïk tɔ̈ në kaam de t-SNE yic.
PBMC aacï keek tek thook tënë kä ye rim tek yiic (Tëknologï de STEMCELL) në thëm de thëm de thëm de Ficoll. CD3 + acï keek tek thook tënë PBMC në luɔɔi de CD3 ë thäät (Miltenyi). Në tɔ̈c de MNA ka tɔ̈c de MNA, CD3+ ë tɔ̈c ë tɔ̈c ë tɔ̈c ë tɔ̈c ë tɔ̈c (5 μg/ml), CD28 ë tɔ̈c (3 μg/ml) ku IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Në kööl de akër de juɛ̈k-juɛ̈k yic, ke pïïr (Kë lëu bï ya tɔ̈ në pïïr yic) ku jɔl ya tɛ̈n lëu benë yen ya juak thïn (123 kuɛ̈n de eBeads, pïïr de raan ëbɛ̈n) acï kek ya caath në thëm de kä ye röt looi në pïu yiic. Cɛɛthë luɔɔi de kä ye röt looi në gɛ̈m de kä ye röt looi në PMA (20 ng/ml) ku ionomycin (1 μg/ml) kenë GolgiStop në thɛɛr kaa 4, ku tïŋ CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) ku TNFore (mäb11, bd). Tääu ë qPCR ku ChIP ë thäät ë PMA (20 ng/ml) ku iönomïcin (1μg/ml) ë thäät kaa 4. ELISA ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät.
Tääu ë lööŋ ke raan ë loi yeen cök ago RNA ya tek thook në luɔɔi de RNeasy plus mini kit (QIAGEN). Luɔ̈ɔ̈i ë QIAshrëdër (QIAGEN) bï kë cï them thɔ̈ɔ̈ŋ. Luɔ̈ɔ̈i ë RNA nɔŋ riɛl dït apɛi tënë këde cDNA (Aciëŋ de Rɛ̈c) bï DNA (cDNA) looi. Luɔ̈ɔ̈i ë TaqMan Rapïd Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) bï kä ye röt looi thɔ̈ɔ̈ŋ (cït mɛn de löŋ de raan ë loi yeen) kenë kee käkë: Hs02786624_g1 [glïcëräldëhïdë-3-pöspät öf Hïdrögën (GAPDH)] ku Hs01010726_m1 (SLC22A2). Kä cï them aacï keek looi në ajuɛɛr de PCR de thaar yic de StepOnePlus (Ajuɛɛr de Kä ye Luɔɔi) (Ajuɛɛr de Kä ye Luɔɔi) në MicroAmp ye lac tïŋ 96-ajuɛɛr de kä ye röt looi (Ajuɛɛr de Kä ye Luɔɔi) keke bidiö de MicroAmp. Kuat Ct ë thööŋ ë 35 wär aye yök ke tɔ̈ nhial në thëm de yök ku ka ye gɔ̈t ke cïï yök.
Luɔi de ChIP cït mɛn cïnë ye lueel wënthɛɛr (58). Në wël lik yiic, ke käk cï kek yök aacï kek ya tɔ̈ɔ̈u në pïu yiic (ciin ë thök ë 1.42%) ku ka cï kek ya tääu në pïu yiic në minit ka 10 yiic. Luɔ̈ɔ̈i ë pïu cï keek juak thïn (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ku 0.1% NP-40) në pïu yiic në minit ka 10, ku jal keek bɛɛr tääu në pïu yiic cït mɛn cïnë keek lueel (58 ). Kë cï them acï thɔ̈ɔ̈ŋ ke thëm cït kën: thëm 10 (20 thëm 1-thök) ku thaar tɔ̈u ë thëm 40. Tääu ë ChIP-grɛdë Immunoglobulin G (Tɛ̈knologï ye käŋ nyuɔɔth; 1μl), histone H3 (Tɛ̈knologï ye käŋ nyuɔɔth; 3μl), NFAT (Tɛ̈knologï ye käŋ nyuɔɔth; 3μl) ku SP1 (Tɛ̈knologï ye käŋ nyuɔɔth; 3μl) kä ye guɔ̈p gël keke kë cï them tɔ̈u nhial CCke Tääu ë mïïth A yiic (Kë ye cɔl Thermo Fisher) kenë kë cï them në 4°C ke ye yiɛ̈ɛ̈k amääth në thaa 1, ku luui kä ye cɔl chelex (Bio-Rad) bï DNA cɔk dït, ku luui ë mïïth K (Kë ye cɔl Thermo Fisher) bï mïïth ya liääp. TNFα ë gɛ̈tgɛ̈t acï yök në PCR: tueŋ, ggg tt cct tgc tg tg; në thööŋ, gtg cca acä act gcc ttt ata tg (207-bp prödükt). Thura aacï keek looi në Thura de Thura (Bio-Rad) ku thɔ̈ɔ̈ŋë keek në luɔɔi de thura de J.
Kë cï yök në ciɛɛŋ de cell yic acï bɛ̈n määtiic cï mɛn cïnë ye lueel nhial ëtënë. Kë cï yök acï looi cït mɛn cïnë kɔc ë loi yen ye lueel në dhöl ë thëm de IL-2 de raan (Invitrogen) ku thëm de IFN-γ de raan (Abcam). Cït tɛ̈n cenë ye lueel thïn në kɔc ëke cak yen, ke pïu cï kek tääu në pïu yiic aacï kek ya tääu në 1:100 ago TNFα ku IL-2 ya yök, ku 1:3 ago IFN-γ ya yök. Luɔ̈ɔ̈i ë ËnVïsion 2104 Multiläbël Rëädër (PerkinElmër) bï thëm de kë ye dɔm në 450 nm.
PBMC aacï keek tek thook tënë kä ye rim tek yiic (Tëknologï de STEMCELL) në thëm de thëm de thëm de Ficoll. CD3 + acï keek tek thook tënë PBMC në luɔɔi de CD3 ë thäät (Miltenyi). Në tɔ̈u de MNA wala tɔ̈u de MNA, CD3+ acï keek tääu në CD3 cï tääu në thät yic (5μg/ml), CD28 cï tääu në thät yic (3μg/ml) ku IL-2 (300 U/ml; Proleukin) në nïn kaa 3 yiic. Në nïn kaa 3 yiic, ke käk ë pïu acï keek määt yiic ku lɔɔk keek në 0.9% de pïu ë pïu yiic, ku pellet acï keek tääu në pïu yiic. Kuɛ̈n de käke guɔ̈p acï looi në thëm de käke guɔ̈p (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R) ke luui 123 kuɛ̈n eBeads.
Tääu ë käŋ bei cït mɛn cïnë keek lueel nhial. Kë cï riɛl acï bɛɛr looi në thëm de 4000 cell thöŋ/μl. Cɛɛth kä cï them në thëm de kä cï röt dhuɔ̈kciëën (1290 cïn thök II, Agilent Teknolögï, Santa Klära, CA) ku thëm de CORTECS T3 (2.1×150 mm, dït de kä thiik 1.6-μm, dït de kä thiik 120-Å; #186008500, Pïu). Kë yenë käŋ tïŋ në piny kɔ̈u (6470, Agilent), wën yenë kä ye röt looi në karaba yic luui në kueer puɔth. A ë thäät ë thäät A ë 0.1% ë thäät ë thäät (në H2O yic), thäät ë thäät B ë 90% ë thäät ë thäät, 0.1% ë thäät ë thäät. LC ë thäät ë 0 agut cï 2 minit tënë 100% A, 2 agut cï minit 7.1 tënë 99% B, ku 7.1 agut cï minit 8 tënë 99% B. Ku dhuk ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë 0.6 ml/min ë thäät kaa 3. . Tɛ̈n ë pïu ë 0.4ml/min, ku ɣön ë pïu ë 50°C. Luɔ̈ɔ̈i ë MNA ë thäät ë thäät ë thäät (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) bï thaa ë gël (RT) ku wɛ̈ɛ̈r ë yic (RT = 0.882 minit, wɛ̈ɛ̈r ë 1 = 137→94.1, wɛ̈ɛ̈r ë 2 = 137→1373) looi. Na cï käŋ kaadiäk ke gɛ̈ɛ̈r rot looi në thaar thöŋ de gël, gɛ̈ɛ̈r 1 aye luɔ̈ɔ̈i ke ye kën thëm bï kä tɔ̈u thïn nyuɔɔth. Kë cï thɔ̈ɔ̈ŋ de MNA (Aciëŋ de Käk ë Rïthäc de Toronto) acï looi në thëm de käŋ kaa dhetem ke pïu cï keek tääu në käŋ yiic (1 mg/ml) bï kä cï keek thɔ̈ɔ̈ŋ ke 0.1, 1.0, 10 ku 100 ng/ml ku 1.0 ku 10μg/ml ë pïu yiic yök. Kë cë yök ë 1 ng/ml, ku thäät ë yök ë thäät ë 10 ng/ml ku 10μg/ml. Tɛ̈m de microliters kaa rou ke kä ye them ku kä ye thɔ̈ɔ̈ŋ aye luɔ̈ɔ̈i tënë LC/MS thëm, ku thëm cï liääp ke gël de piath aye looi në thëm kaa bɛ̈t yiic bï thëm de thëm de käŋ cɔk tɔ̈u. Kä cï MNA ke dhuknhïïm ke käke MNA-cï keek looi abɛ̈n aake tɔ̈u në thëm de thëm yic. Cɛɛth kä cï yök acï looi në luɔɔi de cɛɛth de kä juëc cï yök (v9.0, Agilent).
Riɛ̈ny de rou de αFR-CAR cï looi acï lööm tënë Diɛt ku kɔc kɔ̈k. (59). Në wël lik yiic, ke yïknhial de käŋ ee yic naŋ käjuëc tɔ̈ thïn: CD8a ee raan tueeŋ, αFR de raan, CD8a ye tɔ̈ në thɛɛr juëc yiic, CD27 tɔ̈ në räl yiic ku jɔl ya CD3z tɔ̈ në räl yiic. Kë cï thöl në luɔɔi de CAR acï looi në GenScript, ku ka cï bɛ̈n cak në riɛ̈c de rou de lentiviral në baŋ nhial de GFP yenë käŋ luɔɔi thïn agonë ​​luɔɔiden ya caath.
Lentivirus ee yök në gɛ̈th ë HEK293T [Aciëŋ de Käŋ ë America (ATCC); cil në Dulbecco cï looi në Eagle medium yic nɔŋic 10% de pïu ke thɔ̈k (FBS) ku 1% de PenStrep, ku ka ye luui në CAR-GFP vector ku Kä ye kek määt yiic (psPAX2 ku pMD2.G, Addgene) aye luui në lipofection amine (Sigma-Aldrich). Virus nɔŋic kë tɔ̈ në ye guɔ̈p acï bɛ̈n määt yiic në thɛɛr kaa 48 ku 72 të cïnë yen tääu në raan dɛ̈t peei yic, ku ka cï bɛ̈n ya lɔɔc, ku ka cï bɛ̈n ya tääu në käjuëc yiic. Tɔ̈ɔ̈u kë cï liääp kenë tuanytuɛɛny në -80°C agut cï bï ya waar.
PBMC aye kek tek thook tënë kä ye kek tek yiic në rim yiic (STEMCELL Teknologï) në luɔɔi de Ficoll yenë käŋ tɛ̈ɛ̈k yiic. Luɔ̈ɔ̈i ë käm thiik ke CD8 (Miltenyi) cï kek lɔc yiic agonë ​​CD8+ ya tek thook tënë PBMC. T ë thäät ë T ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë TexMACS [Miltënï; ë tɛ̈ɛ̈u ë 3% ë pïu ë raan cïn ë atuɔ̈c, 1% ë pïu ë raan ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë IL-2 (300 U/ml)]. Në thɛɛr kaa 24 ke thök ë thök, ke T cells aacï keek tääu në lentivirus yic (10 μl ë thök ë thök ë thök ë thök ë 106). 1 agut cï nïn kaa 3 të cïnë Cytek Aurora thök (në FSC (Kë cï Tɛ̈k-tɛ̈k Tueŋ)/SSC (Kë Tɛ̈k-tɛ̈k Tök), Tök, GFP+), aye GFP thɔ̈ɔ̈ŋ në kä cï röt looi yiic agokë luɔɔi de gɛ̈ɛ̈r de käŋ ya nyuɔɔth në ciin de 30% .
CAR-T cells aake cï kek ya tɔ̈ɔ̈u në thɛɛr kaa 24 yiic në Immunocult yic. Na cï thök ë tɔ̈ɔ̈u, ke CAR-T acï keek lɔɔkic në PBS ku tɛ̈ɛ̈uë keek në 20,000 ë SK-OV-3 [ATCC; në McCoy 5A yic (Sigma-Aldrich) cï juak thïn kenë 10% de FBS ku 1% de PenStrep në 10: Kë ye luui në thööŋ de 1 acï juak në käŋ kaa diäk në kë cï juak thïn de Immunocult yic. SK-OV-3 ë thäät ku SK-OV-3 ë thäät cï keek tääu në thäät yiic (0.5mg/ml; Në thɛɛr kaa 24 ke puɔ̈ɔ̈r ë tök, ke pïu cï bɛ̈n bei në pïu yiic aacï kek bɛ̈n määt yiic ku ka cï kek bɛ̈n them cïmën cenë kek ye lueel në raan ë loi yeen (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH cï bɛ̈n bei thïn acï tääu në 1:50 në LDH yic. Ciin de kɔc cï kek nɔ̈k acï them në dhöl kënë yic: ciin de kɔc cï kek nɔ̈k = ciin de kɔc cï kek nɔ̈k = ciin de kɔc cï kek nɔ̈k x 100%, të yenë ciin de kɔc cï kek nɔ̈k = co-culture-T cells yetök, ku ciin de kɔc cï kek nɔ̈k = ciin de kɔc cï kek nɔ̈k = ciin de kɔc cï kek nɔ̈k.
Cït mɛn cïnë ye lueel në wëlke yic wala käŋ ku dhël, luöi GraphPad Prism 8, Microsoft Excel wala R v3.6.0 tënë thööŋ de käthëm. Na cï kä juëc ke kä ye nyuɔɔth määt yiic tënë raan tuaany tök (cït mɛn de ascites ku tumor), ke wɔ ye thëm de t kaa rou luɔ̈ɔ̈i wala matku raan tuaany ke ye kë cï rot looi në thëm de thëm wala thëm de thëm cït mɛn thöŋ yen. Në thëm de kä ye röt waar yiic, ke thëm de kë thiekic aye looi në käŋ kaadiäk.
Të wïc yïn kä juëc kɔ̈k ë athör kënë yic, ka yï tïŋ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1.
Yekënë ee kë cï gɔ̈t ë yök ë thok cï tɛkpiny në lööŋ ke Creative Commons Attribution-Cie-Kë-Cie-Kë-Cï-Kë-Tajir, ye puɔ̈l bï luui, tɛkpiny ku gɛ̈t-piny në gɛɛr de kueer, të cïnë luɔɔi de akër cie kën yök de tajiir ku kë tɔ̈u thïn ee naadɛ̈ ke luɔi thɛɛr ee yic. Wël ye ke lueel.
Tïŋ: Ɣok a wïc yïn ba athör duɔ̈ɔ̈n ë gɛ̈tgɛ̈t tääu-pïny rin bï raan ë gɛ̈tgɛ̈tdu tääu-pïny ŋic lɔn wïc yïn keek bïk gɛ̈tgɛ̈t tïŋ ku lɔn cie gɛ̈tgɛ̈t ë gɛ̈tgɛ̈t. Wek aacïï bï lööŋ ke email dɔm.
Kë thiëc kënë aye looi bï yïn them lɔn yïn ee raan ë yök ku gël ë thäät ë thäät ë thäät.
Märïsä K. Kilgöur (Märïsä K. Kilgöur), Sära MäcPhërthön (Sära MäcPhërthön), Lärën G. Dhächarias (Lärën G. Dhächarias), Abigäil Eli Arïs G. Wäthön (H. Wäthön), Jöon Stägg (Jhn Stägg), Bräd H. Rösël Dëbël (Brad H. Nɛlthön), Ralph J. Dë Bëll. (Ruthël G. Jönëth), Pïnïäth T. Hämïltön (Pïnïäth T.
MNA ee T cells cɔk gël guöp ku ye tɔ̈ ke ye kën lëu bï guöp ya gël agonë ​​tuanytuɛɛny ke cancer ya töök.
Märïsä K. Kilgöur (Märïsä K. Kilgöur), Sära MäcPhërthön (Sära MäcPhërthön), Lärën G. Dhächarias (Lärën G. Dhächarias), Abigäil Eli Arïs G. Wäthön (H. Wäthön), Jöon Stägg (Jhn Stägg), Bräd H. Rösël Dëbël (Brad H. Nɛlthön), Ralph J. Dë Bëll. (Ruthël G. Jönëth), Pïnïäth T. Hämïltön (Pïnïäth T.
MNA ee T cells cɔk gël guöp ku ye tɔ̈ ke ye kën lëu bï guöp ya gël agonë ​​tuanytuɛɛny ke cancer ya töök.
©2021 Akutnhom de Kɔc ke Amɛrika de Luɔɔi de Käke Nyic. lööŋ kedhiɛ aacï keek tɔ̈ɔ̈u. AAAS ee partner de HINARÏ, AGORA, OARË, CHORUS, CLOCKSS, CROSSREF AND COUNTER. Lɔtueŋ de Nyïc ISSN 2375-2548.