Tɛ̈ yenë mïïth tɛ̈ɛ̈k yiic në dhöl yenë kek tɔ̈ɔ̈u thïn ee kë thiekic apɛi ago cells ya cɔk tɔ̈ apath ku bïk ya rëër apath. Në ye wɛ̈t kënë yic, ke luɔɔi de lipids në kinesin yic në tɛ̈n yenë käŋ ɣaac wei thïn ee kë cï lac ya thiɛ̈c ku ka këc dhuknhom. Ëtënë, ɣok aye 3D looi në thaa tökic në kïït juëc yiic ye thura looi në thaŋ yic agoku käŋ ya nyuɔɔth në vivo yic ke mïïth cï kek ya cak në mïïth yiic ku ka ye kek tek yiic në mïïth yiic në ɣän wääc yiic yenë kek jäl thïn. Në ye kënë nhom, ke ɣok aye nyuɔɔth ke thëm de ceramide tɔ̈ në pïu yiic ee kë thiekic apɛi tënë tɛ̈n yenë käŋ tɛk thïn. Puɔ̈ɔ̈cda ee kä tueeŋ ye yith nyuɔɔth në vivo yic agonë ​​mïïth ya tek thook cï tɛ̈n yenë lipid chain ya lɔ thïn agokë ya lɔ në ɣän yenëke käŋ lɔ ɣaac wei thïn.
Në räl ke eukaryotic yiic, ke mïïth ye kek looi në endoplasmic reticulum yic (ER) aye kek tek yiic në thɛɛr yenë kek lɛɛr thïn agokë ya lɛɛr tëden rɔ̈ŋ kek thïn (1). Në ye kënë yic, ke ka cï ya lac lueel ke lipids kɔ̈k peei alëu bïk ya luui ëyadɛ̈ në tɛ̈n yenë kek määt yiic në ɣän kɔ̈k peei yiic agonë ​​mïïth ya cɔk lɔ tueŋ apath (2-5). Ku na yïn ya, ke ka ŋoot ke cïn käjuëc ye yen nyuɔɔth në vivo yic agonë ​​ye luɔɔi kënë ya nyuɔɔth ke lipid. Në kë bïnë ye kë rɛɛc kënë ya cɔ̈kpiny, ke ɣok acï puɔ̈ɔ̈c looi në yeast yic në tɛ̈n yenë mïïth ke GPI (GPI-APs) tɔ̈ në ER yic ya lɛɛr aɣeer në dhɔ̈l wääc yiic. GPI-APs aye kä juëc ke pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ( 6, 7). GPI-AP ee kë ye yök në pïu yiic ye thiääk kenë pïu tɔ̈ në pïu yiic në biäk de pïu yiic (GPI anchor). Aye GPI gam ke ye kë cï tɔ̈ɔ̈u në thɛɛr ke wɛ̈ɛ̈rë yic në ER lumen (8). Na cï GPI-AP tääu në dhöl yic, ke GPI-AP ee tëëk në dhöl de Golgi yic (5, 9) në ER yic agut cï dhöl de plasma yic. Tɛ̈n yenë GPI tɔ̈ thïn ee GPI-AP cɔk tɔ̈ ke wääc kenë mïïth ye kek tääu në pïu yiic (cïmën de mïïth kɔ̈k peei ye kek tääu në pïu yiic) në dhöl yenë kek tääu thïn (5, 9, 10). Në yeast yiic, ke GPI-APs aye kek tek thook tënë mïïth kɔ̈k peei ye kek tɔ̈ɔ̈u në mïïth yiic, ku ka ye kek määt yiic në mïïth wääc yiic cï kek ya thiɔ̈ɔ̈ŋ në mïïth yiic (COPII) (6, 7). Kä ye tɔ̈ në ajuɛɛr de tɛ̈ŋ yic de ER yic acie ŋic apath, ku ka ye lueel ke ajuɛɛr kënë alëu bï ya wïc në lipids, cïmën de tɔ̈ɔ̈u de lipids në biäk de GPI anchor (5, 8). Në yeast yic, ke GPI ee rot lac looi të cïnë GPI rot tääu thïn, ku në ɣän juëc yiic, ke ka ye pïu cɔk tɔ̈ në pïu yiic (C26:0) (11, 12). C26 ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu. Aye looi në ER yic ku käjuëc ke kek aye kek lɛɛr në Golgi yic në COPII yic (13). ER ye GPI-AP bɛ̈i bei ee kë wïc bï ya ŋoot ke lɔ tueŋ (14, 15), ku në thɛɛr kɔ̈k yiic, ke gɛ̈ɛ̈r de käŋ në kä ye kek tääu në käŋ yiic (IPC) në adit ke Golgi yiic ee pëk në luɔɔi de GPI (16). Puɔ̈ɔ̈c de kä pïr kenë kä cï kek looi në kɔc cin acï ya nyuɔɔth ke kä bäär apɛi ke acyl aye röt mat agokë käjuëc wääc ya cak (17, 18). Kä cï kek yök ëtënë acï wël bɛ̈n lueel ke C26 ceramide ku jɔl ya GPI-AP kenë C26 ceramide aye käken ye kek tïŋ ya luɔ̈ɔ̈i agokë röt ya määt në ɣän cï kek juiir yiic ka ɣän tɔ̈ në ɣän thiääk kenë ER yiic. Aye tɔ̈ ke ye tɔ̈ ke ye tɔ̈ ke ye tɔ̈ ke cë thök ku cë thök (C16:1 ku C18:1) (19, 20). Käk abï kek ya kuanycök në ɣän yenë ER jäl thïn (ERES), man yenë GPI-AP tɔ̈ në pïu yiic ya lɛɛr në Golgi yic në dhöl töŋ cï looi yic ke COPII (5).
Në ye puɔ̈ɔ̈c kënë yic, ke ɣok acï ye ajuiɛɛr kënë ya them në luɔɔi de adit yenë käŋ tïŋ në thɛɛr juëc yiic (SCLIM), man ye ya ajuiɛɛr yenë käŋ tïŋ në thɛɛr juëc yiic ago mïïth ya tïŋ në thaa tökic. (21, 22).
Acuk tëët de SCLIM kɔn ya luɔ̈ɔ̈i agoku ya guiir në tɛ̈n yenë GPI-AP tɔ̈ kenë akut de C26 ceramide ya caath thïn të cenë ER jäl në S. ceramide yic. Në kë bïnë ER tek yic, ɣok acï ajuɛɛr de gɛ̈th luɔ̈ɔ̈i lëu bï kä yam cï kek cak ya tïŋ apath ku bïk lɔ në ERES yic në vivo yic (7, 23). Ke ye kë ye tääu në käŋ yiic, ɣok acï C26 cï tääu në GPI-AP Gas1 yic cï gɔ̈t ke nɔŋ kë ye cɔl GFP ku kë ye yök në pïu yiic ye cɔl Mid2 cï gɔ̈t ke nɔŋ kë thiääk kenë pïu ye pïu cɔk bɔ̈ bei (iRFP), kee käkë kedhiɛ aye pïu yök në pïu yiic (24–26). Në sec31-1 ye rot waar në atuɔ̈c yic, ke käŋ kaarou käkë aye kek nyuɔɔth në kë ye galactose cɔk loi rot ku jɔl ya kë ye ERES nyuɔɔth. Në thɛɛr ke atuɔ̈c yiic (37°C), në kë yenë sec31-1 rot waar në luɔɔi de COPII yic ago cil de COPII ya gël ku bï ER ya lɛɛr aɣeer, ke kä yam cï kek cak aye röt määt në ER yic (23). Na cï liɛɛr në atuɔ̈c thiin koor yic (24°C), ke sec31-1 ee rot waar në ɣän yenë käŋ tɔ̈ɔ̈u thïn, ku kä yam cï kek määt yiic acï röt bɛ̈n jɔɔk bï kek ya ɣaac wei në ER yic. CLIM acï nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke kä juëc ke Gas1-GFP ku Mid2-iRFP cï keek looi yam aŋot ë ke tɔ̈u në ER de sec31-1 cï röt waar yiic të cïnë keek tääu në 37°C yic ku ka cï keek bɛ̈n jäl në 24°C yic në minit ka 5 (Thiɛ̈ŋ 1). Cï mɛn yenë Mid2-iRFP tɛkpiny në ER ëbɛ̈n yic, ku Gas1-GFP ee rot määt ku määt rot në ɣän ke ER cïï thöŋ yiic, ke tɛ̈kden ee wuɔ̈ɔ̈c apɛi (Thiɛ̈ŋ 1, A agut cï C ku Film S1). Në ye mɛn, cït mɛn cïnë ye nyuɔɔth në Thura 1D yic, ke akutnhom de Gas1-GFP acïn Mid2-iRFP. Kä cï kek yök ëtënë aye nyuɔɔth ke GPI-AP ku jɔl ya mïïth ke ER acï kek ya tek yiic në ɣän wääc ke ER yiic në thɛɛr tueeŋ yiic. Akutnhom de Gas1-GFP ee thiääk kenë ERES cï gɔ̈t në mïïth ke mCherry yiic.
sec31-1 cells aye kä cï röt looi ke galactose nyuɔɔth, kën bäär apɛi de acyl (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, maŋök) ku kä ye cath në pïu yiic ke Mid2-iRFP (TMP, mathiäŋ) ku kën ye cɔl Constructive ERES cï gɔ̈t në Sec13-mEScu në minit, jäl 24°C, ku thööŋë SCLIM minit 5 ë thää. (A agut cï C) ee kë cï mat wala thura töŋ de 2D de riän nhial nyuɔɔth (A), thura de 2D de 10 z-tök (B) wala thura de 3D de käke piny de kä ye cath ku kä ye ERES nyuɔɔth (C). Thëm 1μm (A ku B). Kë yenë them ee 0.551μm (C). Gas1-GFP acï yök në ɣän wääc yiic ke ER wala akuut yiic, ku Mid2-iRFP acï yök ku tɛkpiny në ER yic (C). (D) Kë cï thuur ee thöŋ de riɛl de pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu. AU, kën ë lööŋ. (E ku F) aye thura de 3D nyuɔɔth ye käŋ mat yiic ku ERES ë thööŋ. Akutnhïïm ke Gas1-GFP aacï kek yök të thiääk kenë ERES. Kë yenë them ee 0.551μm. (F) Kë ɣer cï thɔ̈ɔ̈r acï akutnhom de Gas1-GFP thiääk kenë ERES nyuɔɔth. Kë tɔ̈ ciɛɛl ku kë tɔ̈ në baŋ ciɛɛm aye thura de 3D cï mat yiic nyuɔɔth ku tïŋ cï rot wïïc de akutnhom de Gas1-GFP cï kuany.
Ruääi thiääk kenë akut de Gas1-GFP ku jɔl ya ERES tök ee yen nyuɔɔth ke Gas1-GFP alëu bï ya lɔ në ERES cï kuany yic, man ye wuɔ̈ɔ̈c kenë tɛ̈n yenë Mid2-iRFP luui thïn ago ER ya jäl. Ku bï ye kën lëu rot looi, ɣok acï thööŋ de ERES thɔ̈ɔ̈ŋ ke kë tök wala käŋ kaa rou (Thöŋ 2, A agut cï C). Acuk yök ke ERES juëc (70%) anɔŋic dhöl töŋ de gɛ̈th. Thura tɔ̈ piiny në Thura 2C yic ee käŋ kaa rou ke ERES nyuɔɔth ke nɔŋ Gas1-GFP yetök (Thöŋ 1) wala Mid2-iRFP yetök (Thöŋ 2). Në thööŋ, ke thööŋë ke ye 20% de ERES anɔŋic käŋ kaa rou ye röt mat në ɣän thöŋ yiic. Acï yök ke ERES kɔ̈k (10%) anɔŋic käŋ kaa rou ke thɛ̈ny, ku keek aacï keek tek yiic në ɣän wääc yiic ë ke ŋic keek. Ku na yïn ya, ke thööŋ de kä cï kek yök ëtënë ee yen nyuɔɔth ke ER cï bɛ̈n ya tääu në bɛ̈i kɔ̈k peei yiic, ke GPI-AP Gas1-GFP ku jɔl ya kä ye kek tääu në pïu yiic ke Mid2-iRFP aye kek tek yiic në ERES wääc yiic (Thiɛ̈ŋ 2D). Tɛ̈n yenë käŋ tɛk thïn ee thöŋ kenë tɛ̈n cenë käŋ ya caath thïn wënthɛɛr (6) ku jɔl ya tɛ̈n yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ thïn (7). Ku ɣok alëu buk yök aya lɔn ye aciëëk ke ɣön ë tɔ̈ɔ̈u cï tääu ë ERES yic (Thöŋ 2E ku Film S2). Thura 2E ee nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke biäk thiin de Gas1-GFP (akut 3) wala Mid2-iRFP (akut 4) ee lɔ në ERES yic në baŋ tök ku ka cï mac në ɣän wääc yiic. Panel 5 de Thura 2E ee nyuɔɔth ke Gas1-GFP ku Mid2-iRFP aye yök në thɛɛr kɔ̈k yiic në ERES tökic, ku ka ye lɔ në ɣän wääc yiic ku ka ye röt määt në ɣän wääc yiic lëu bïk COPII wääc ya nyuɔɔth. Acuk yök ëyadɛ̈ ke tɛ̈ŋ yic cï tïŋ ku tɛ̈ŋ de yic de C26 cï tääu në GPI-AP Gas1 yic ke ye ERES cï kuany ee kë tɔ̈ ke ye yic në kë yenë käjuëc tɔ̈ në pïu yiic tɔ̈ në pïu yiic, man ye GFP tääu në pïu yiic në pïu yiic, man ye aciëëk thöŋ kenë Mid2-iRFP nyuɔɔth. (Thuɔ̈ɔ̈r S1 ku Thura S3). Axl2-GFP cï yam looi aye tɛkpiny në ER yic cïmën de Mid2-iRFP (Thöŋ de S1, A ku B), ku ka ye tɔ̈ kenë Mid2-iRFP në ERES juëc yiic (Thöŋ de S1, B agut cï D). Panels 1 ku 2 ke Thura 1. S1C ee käŋ kaa rou ke ERES nyuɔɔth të yenë käŋ kaa rou ke thëm de käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ. Në kee käkë yiic, ke käŋ kedhiɛ aye lɔ në ERES yic në tök (Thiɛ̈ŋ S1E, Akutnhom de 3 ku Cinima S3).
Kä ye tɔ̈ në 31-1 yiic ye tɔ̈ në 37 yic të cïnë kek tääu në 37 yic në minit kaa 30 ke °2. blök, ku thura ke SCLIM ë thää 20 yiic. (A agut cï C) Thuraa ke 2D ye nyuɔɔth (A; thëm de käŋ, 1 μm) wala thuraa ke 3D ke pinynhom (B ku C; thëm de käŋ, 0.456 μm) de kä ye tääu në käŋ yiic ku 10 z-tök cï keek gɔ̈t në ERES. Kë tɔ̈ piiny në (B) ku kë tɔ̈ në (C) yic aye thura cï looi nyuɔɔth bï kä tɔ̈ në ERES yic nyuɔɔth (kë ɣer) [Aliir 1-GFP (kë ɣer) ku Mid2-iRFP (kë ɣer)]. (C) Athör ë ɣöt thok: ERES ee thäät tök ë thäät ë thäät ë thäät (1 agut 4). Athör ë thäät: ERES anɔŋic kä cï ke tek yiic (5). Kë ɣeer ril: ERES nɔŋic kä ye tääu tëtök. Në piny: ERES tök cï kuany anɔŋic Gas1-GFP (1) wala Mid2-iRFP (2) yetök. Thëm kë, 100 nm. (D) Thëm de thura cï lueel në (C). Ciin ciɛɛl de ERES nɔŋic kë tök yetök (Gas1-GFP wala Mid2-iRFP), kä cï ke tek thook ku kä cï röt mat. Në käŋ kaa diäk cï ke looi yiic, n=432 në käŋ kaa 54 yiic. Bar ë rɛ̈ɛ̈c = SD. Tëst t t ünpäïrëd tö-täïlëd. P = 0.0002. (E) 3D thura de ERES cï kuany de kä cï keek mac cï keek gɔ̈t në (C). Gas1-GFP (kë ɣer) (3) ka Mid2-iRFP (kë ɣer) (4) ee lɔ në ERES (kë ɣer) yic në baŋ tök ku ka ye gël në ɣän thii tɔ̈ në ERES yic. Në thɛɛr kɔ̈k, ke käŋ kaa rou ke käŋ aye lɔ në ERES tökic (5) në baŋ tökic ku ka ye keek mac në ɣän cï keek tek yiic në ERES yic. Thëm kë, 100 nm.
Në ye cök ciëën kënë yic, ke ɣok acï wël cï kek lueel bɛ̈n them në kë cenë acyl dït apɛi (C26) tɔ̈ në ER yic ya cɔk tɔ̈ në akuɔ̈tnhïïm yiic ku bï Gas1 ya tɛk në ERES yic. Në thök de ye wɛ̈t kënë yic, ɣok acï miɔ̈k cï looi cɔl GhLag1 bɛ̈n looi, man yenë käŋ kaarou ye cɔl Lag1 ku Lac1 waar në GhLag1 (kë ye Lag1 thöŋ kenë cotton), ku kän acï miɔ̈k bɛ̈n ya yök ke nɔŋ miɔ̈k cï lac thök në miɔ̈k de miɔ̈k yic (Thiɛ̈ŋ 3A) (2). Cɛɛth cï looi në thëm de kä juëc (MS) acï nyuɔɔth ke në kä tɔ̈ në tiɔpic yiic, ke 95% de ciin de käm ëbɛ̈n ee bɛ̈ɛ̈r apɛi (C26) ku në GhLag1 yic, ke 85% de käm abäär apɛi (C18 ku C16). ), 2% ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät (C26) ë thäät ë thäät. Na cɔk C18 ku C16 ya tɔ̈ ke ye kä tueeŋ cï kek yök në GhLag1 yic agut cï yemɛɛn, ke MS acï ya yök ëyadɛ̈ ke GPI yenë Gas1-GFP tɔ̈ në GhLag1 yic ya tɔ̈ ke nɔŋic C26, man ye thɔ̈ɔ̈ŋ kenë kä tɔ̈ në tiɔpic. Ku ë thöŋ ë thöŋ (Thöŋ 3A) (26). Ku na yïn ya, ke wɛ̈t kän ee yen nyuɔɔth ke Cwh43 ee tɔ̈ ke ye raan ë tɔ̈ në thɛɛr ke C26 yiic, cïmën cenë ye nyuɔɔth në thura de 26 yic, ku ka ye tɔ̈ ke ye tɔ̈ ke ye tɔ̈ ke ye tɔ̈ në GPI anchor yic në thɛɛr thii ke C26 yiic në thɛɛr ke GhLag1 yiic. S2 (29). Ku na yïn ya, ke mɛ̈c ke GhLag1 aye naŋ C18-C16 yetök, ku Gas1-GFP aŋot ke nɔŋ C26. Ë yic kënë ee këpath kënë cɔk ye këpath bï kä dhal kɔc ke acyl ya cɔ̈kpiny në ER yic. Luɔɔi de piööc de thukul ku tɛ̈ŋ de yic. Ku, ɣok acï thɛɛr kueen lɔn yenë C26 Gas1-GFP rot määt në akuut yiic në GhLag1 yic ke nɔŋ kë ye rot waar në atuɔ̈c yic në thɛɛr ke tɔ̈c yiic, të yenë tɔ̈c bäär (C18-C16) tɔ̈ në ER tɔ̈c yic (Thöŋ. 3). Acuk tïŋ ke tɔ̈ në thɛɛr ke 31-1 yiic, ke thɛɛr juëc ke Gas1-GFP aake cï röt määt në akuut yiic, ku thɛɛr juëc ke Gas1-GFP aake cï röt määt në akuut yiic, ku thɛɛr juëc ke Gas1-GFP aake cï röt määt në akuut yiic, ku thɛɛr juëc ke Gas1-GFP aake cï röt määt në akuut yiic, ku thɛɛr juëc ke Gas1-GFP aake cï röt määt në akuut yiic, ku thɛɛr juëc ke Gas1-GFP aake cï röt määt në akuut yiic, ku thɛɛr juëc ke Gas1-GFP aake cï röt määt në akuɔ̈tnhïïm yiic kedhiɛ. Ku bï ya yic, në kë yenë C26 ceramide thiääk kenë ERES (Thoŋ 1), ɣok acï bɛ̈n ya thiëëc mɛn lëu bï ye luɔɔi kënë ya naŋ luɔɔi de ER yenë käŋ ɣaac wei. GPI-AP ee ajuɛɛr de COPII ë ER ë thäät yiic luɔ̈ɔ̈i, man ye lac mac në Ted1′s ë thäät yiic ë thäät yiic ë thäät yiic ë thäät yiic (30, 31). GPI-glycan cï kek bɛɛr määt yiic aye lac ŋic në p24 ye käŋ dɔm, man ye Lst1 kuanycök, man ye ya kë tɔ̈ në akut de COPII yic ye käŋ rek në Sec24, ku ye GPI-AP-riëc de COPII-31 looi. Ku na yïn ya, ke ɣok acï käjuëc ye röt waar yiic kaarou bɛ̈n määt yiic ku cï käjuëc ke p24 ya nyaai (man ye p24 cɔl Emp24, GPI-glycan ye cɔl Ted1 ku jɔl ya Lst1) kenë käjuëc ye röt waar në sec31-1 yic, ku kuenku kek. Acuk tïŋ ke në thɛɛr ke 31-1emp24Δ ku thɛɛr ke 31-1ted1Δ, Gas1-GFP ee tɔ̈ ke cïn kë cï määt yic ku ka ye tɛkpiny në ER membrane yic, cïmën cenë ye tïŋ wënthɛɛr në thɛɛr ke 31-1 GhLag1, ku në thɛɛr ke 31-1lst1Δ, ke Gas1-GFP cït mɛn de thɛɛr ke 3. Kä cï kek yök ëtënë aye nyuɔɔth ke tɔ̈ në ER yic, ke akut de Gas1-GFP ee wïc bï rot ya rek kenë p24, ku ka cïï Lst1 ye wïc bï ya yök. Ku na yïn ya, ke ɣok acï kä lëu bïk röt ya looi ya tïŋ ke bɛ̈ɛ̈r de ceramide tɔ̈ në ER yic alëu bï Gas1-GFP ya cɔ̈kpiny në p24 yic. Ku na yïn ya, ke ɣok acï yök ke tɔ̈ de C18-C16 në pïu yiic acie GPI-glycans cï bɛɛr looi në p24 ë pïu yiic (Thöŋ S3 ku S4, A ku B) ka ye tɔ̈ ke cï thiääk kenë GPI-AP ku ye GPI-AP ɣaac wei. kë lëu. Tääu ë COPII ë thäät ë Lst1 (Thöŋ S4C). Ku na yïn ya, ke akuɔ̈tnhïïm ye röt gɛɛi në C26 ceramide yic acïï mïïth ye wïc bïk ya mat kenë ER wääc ye mïïth ya ɣaac wei, ku ka ye dhɔ̈l kɔ̈k peei ye kek tek yiic në lipid yiic. Ku, ɣok acï thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de ER yic thiekic tënë thëm de thëm de Gas1-GFP ke ye ERES cï kuany. Në kë yenë Gas1 tɔ̈ në GhLag1 yic nɔŋ thäm thiin koor ye jäl në ER yic ku leer në plasma yic (Thiɛ̈ŋ S5), ke ɣok aye gam ke të yenë käŋ tɛ̈ɛ̈k yiic në bɛ̈ɛ̈r de thäm de acyl, ke Gas1 tɔ̈ në GhLag1 yic alëu bï ya dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n ku bï ya tëëk. ERES käŋ ë thöŋ ë thöŋ.
(A) Aciëŋ de GhLag1 ee naŋ kä thii ke C18-C16, ku GPI yenë Gas1-GFP tɔ̈ thïn aŋot ke nɔŋ C26 IPC thöŋ kenë kä tɔ̈ në tiɔpic. Në nhial: thëm de thëm de acyl në thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm (Wt) ku GhLag1p në thëm de thëm de thëm (MS). Kä cï yök aye ciin de ciin de ceramide ëbɛ̈n nyuɔɔth. Kë ciɛɛl de käŋ kaa diäk cï röt looi keepɛ̈i. Bar ë rɛ̈ɛ̈c = SD. Tëst t t ünpäïrëd tö-täïlëd. **** P <0,0001. Kë tɔ̈ piiny: Cɛɛth de MS de bɛ̈ɛ̈r de acyl de IPC tɔ̈ në Gas1-GFP yic (GPI-IPC) GPI yenë käŋ tääu në käŋ yiic ku jɔl ya käŋ ke GhLag1p. Kä cï yök aye ciin de bɔɔtic de thööŋ de IPC nyuɔɔth. Ciin ciɛɛl de käŋ kaa dhiëc ke nyooth lääu. Bar ë rɛ̈ɛ̈c = SD. Tëst t t ünpäïrëd tö-täïlëd. ns, acie kë thiekic. P = 0.9134. (B) Kä thiik ke 31-1, 31-1 GhLag1, 31-1emp24Δ, 31-1ted1Δ ku 31-1lst1Δ kä thiik ke rɛ̈l ye galactose-cï cak në Gas1-GFP acï keek tääu piny në 37°C në minit kaa 30. wën cï 24°C thök. Kë ɣeer cï thɔ̈ɔ̈r: Akutnhom de ER Aliir1-GFP. Kë cï liep thok: Gas1-GFP cï määt yic aye tɛkpiny në ER yic ëbɛ̈n, ye ER nyuɔɔth ke ye kë cï riääk. Thëm kë, 5μm. (C) Thëm de thura cï lueel në (B). Ciin ciɛɛl de kä cï röt looi ke Gas1-GFP. Në käŋ kaa diäk cï ke looi yiic, n≥300 ke käke guɔ̈p. Bar ë rɛ̈ɛ̈c = SD. Tëst t t ünpäïrëd tö-täïlëd. **** P <0,0001.
Ku bï kë cï riääk kënë ya cɔ̈kpiny, ɣok acï SCLIM ya tïŋ në GhLag1 yic kenë sec31-1 ye tɔ̈ në thɛɛr ke tɔ̈c yiic (Thöŋ de 4 ku jɔl ya cinema de S4). Na cï ER tɔ̈ɔ̈u në 37°C ku jäl jäl në 24°C yic, ke käjuëc ke Gas1-GFP cï kek cak në thɛɛr kɔ̈k yiic aake këc röt määt ku ka cï kek tɛkpiny në ER yic, cïmën cenë kek ya tïŋ në kä thi kor yenëke käŋ tïŋ (Thoŋ 4, A ku B ). Në ye mɛn, ke dït de ERES (67%) anɔŋic käŋ kaa rou ke cargo cï keek tääu thïn (Thiɛ̈ŋ 4D). Käŋ 1 ku 2 ke Thura 4C aye käŋ kaarou nyuɔɔth ke ERES kenë Gas1-GFP ku Mid2-GFP cï röt mat. Në ye mɛn, ke käŋ kedhiɛ aake cï kek tääu në ERES tökic (Thöŋ 4E, panel 3 ku cinema S4). Ku na yïn ya, ke kä cï kek yök në ye luɔɔi kënë yic aye nyuɔɔth ke bɛ̈ɛ̈r de ceramide acyl tɔ̈ në ER yic ee kë thiekic ye ER protein määt yiic ku bï kek ya tek yiic.
Sec31-1 GhLag1 kä ye tɔ̈ në pïu yiic aye tɔ̈ në 37°C yic. Lɔ tueŋ ë minit ka 30, tääu piny ë 24°C bï pïu ë pïu ë pïu yiic jäl, ku thura ke SCLIM ë minit ka 20 yiic. (A agut cï C) Thuraa ke 2D ye nyuɔɔth (A; thëm de käŋ, 1μm) wala thuraa ke 3D ke pinynhom (B ku C; thëm de käŋ, 0.45μm) de 10 z-tök cï keek gɔ̈t në kä ye tääu në käŋ yiic ku ERES. Kë tɔ̈ piiny në (B) ku kë tɔ̈ në (C) yic aye thura cï looi nyuɔɔth bï kä tɔ̈ në ERES yic nyuɔɔth (kë ɣer) [Aliir 1-GFP (kë ɣer) ku Mid2-iRFP (kë ɣer)]. (C) Kë ɣeer cï thiäŋ në thëm: ERES, käŋ cï röt mat. Aciëŋ ë thäät: ERES anɔŋic kë tök. Panel tɔ̈ piiny: ERES cï kuany anɔŋ käŋ cï röt mat (1 ku 2) cï keek gɔ̈t në (C). Thëm kë, 100 nm. (D) Thëm de thura cï lueel në (C). Në thɛɛr ke 31-1 ku 31-1 ke GhLag1, ke thëm töŋ de thëm (Gas1-GFP wala Mid2-iRFP) yenë ka tɔ̈ thïn, ku thëm de thëm de ERES tënë thëm cï tek yic ku thëm cï tääu në thëm tökic. Në thëm de käŋ kaadiäk cï röt looi keepɛ̈i, n = 432 në 54 ke käŋ yiic (tök31-1) ku n = 430 në käŋ kaa 47 yiic (tök31-1 GhLag1). Bar ë rɛ̈ɛ̈c = SD. Tëst t t ünpäïrëd tö-täïlëd. *** P = 0.0002 (sëc31-1) ku ** P = 0,0031 (sëc31-1 GhLäg1). (E) Thura de 3D de ERES cï kuany ke nɔŋ kä juëc cï röt mat (3) cï keek gɔ̈t në (C). Gas1-GFP (mathiäŋ) ku Mid2-iRFP (mathiäŋ) aye ERES (mathiäŋ) thiääk kenë baŋ töŋ ku rëërkë të töŋ cï ERES gël thïn. Thëm kë, 100 nm.
Puɔ̈ɔ̈c kän ee kä ye yith nyuɔɔth në vivo yic ke mïïth ye kek cam në lipid yiic aye kek tek yiic në ɣän yenëke käŋ ɣaac wei thïn në dhöl yenë kek lac lɔ thïn yiic, ku ye piath de acyl chain length nyuɔɔth agonë ​​kek ya tek yiic. Në luɔɔi de ajuiɛɛr rilic apɛi ye cɔl SCLIM, ɣok acï Gas1-GFP yam cï looi bɛ̈n nyuɔɔth (man ye pïu dït apɛi ke GPI-AP nɔŋ thäm bäär apɛi (C26) në biäk de lipid) në yeast yic. ë ER mëmbrënë (Tïŋ 1). Në ye mɛn, ke käŋ kaa rou ke käŋ aye lɔ në ERES wääc yiic ke cï keek kuany (Thiɛ̈ŋ 2). Aciëŋ de acyl në mɛ̈c yiic ee rot dhuɔ̈kciëën në C26 agut cï C18-C16, ku akut de Gas1-GFP ee rot riɔ̈ɔ̈k në ɣän wääc yiic ke ER, ku Gas1-GFP ee rot dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n bï ER waan kenë mɛ̈c yiic në ERES töŋ kënë yic (Thoŋ de 3 ku Thura de 3). 4).
Na cɔk GPI-AP ya luui në ajuiɛɛr ë mïïth yiic ago ER ya nyaai, ke ɣok acï bɛ̈n yök ke C26 ceramide ee rot gɛɛi në mïïth wääc yiic lëu bïk ERES ya cɔk loi rot (Thoŋ S4 ku S5). Në ye nyin kän yic, ke kä cukku kek yök aye dhɔ̈l kɔ̈k peei ye kek tek thook në lipid yiic ku jɔl ya käjuëc kɔ̈k peei ye kek nyaai. Kä cukku ke tïŋ aye nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke ɣän ke Gas1-GFP wala akutnhom thiääk kenë ERES acïn kën ye tɔ̈ në pïu yiic ye cɔl Mid2-iRFP, ye nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke akutnhom de GPI-AP ye rot gɛɛi në C26 ceramide abï lɔden cɔk loi rot në ERES thiääk kenë yeen yic, ku në yee thaar töŋë yic, ke kën ye pïu cɔk bɔ̈ bei thïn ( 2). Në thööŋ, ke tɔ̈ de C18-C16 në ER yic acie GPI-AP ye cɔk loi ɣän ka akuɔ̈tnhïïm, ku ka cïï mïïth ye tɔ̈ në ER yic ye nyaai ka ye kek waar në ERES tökic (Thoŋ 3 ku 4). . Ku na yïn ya, ke ɣok acï bɛ̈n jam wu C26 ceramide ee käŋ tek yiic ku bï kek ya tek yiic në tɛ̈n yenë mïïth röt määt në ERES yic.
Ye dhöl yïndë yen lëu bïnë C26 ye tɔ̈ në thɛɛr ke ER yiic ya yök? Tɛ̈n yenë pïu tɔ̈ në pïu yiic tek yiic në baŋdɛ̈t peei yic, alëu bï GPI-AP ku jɔl ya C26 ya cɔk loi röt në pïu yiic në ɣän juëc yiic ke pïu yiic në pïu yiic në pïu yiic në ER yic, man ye naŋ pïu thii kor ku cïï pïu yiic ye lac thiɔ̈ɔ̈ŋ. Käk ë thäät ë thäät (17, 18). Kä thiik ke akuɔ̈tnhïïm käkë alëu bïk ya ŋoot ëke ye röt mat në akuɔ̈tnhïïm dït yiic, ku bïk ya rëër apath të cenë kek röt ya rek kenë p24 complex (34). Cït mɛn de kën, ɣok acï nyuɔɔth lɔn ye C26 Gas1-GFP wïc bï mat kenë p24 ril yic bï akuut dït ye tïŋ looi (Thiɛ̈ŋ 3). Ajuɛɛr de p24 ee kë nɔŋ käjuëc wääc yiic kaaŋuan ye tɔ̈ në yeast yic (35), man ye käjuëc wääc yiic bɛ̈i, man lëu bï akuɔ̈tnhïïm thi kor ke GPI-AP ya rek, ku ye akuɔ̈tnhïïm dït apɛi cak (34). Mɛ̈tmɛ̈t në kaam de mïïth ke GPI-APs alëu bï kek ya cɔk määt röt ëyadɛ̈, cïmën cenë ye nyuɔɔth në thɛɛr yenë kek cath në Golgi yic në läi yiic (36). Ku na yïn ya, ke C18-C16 ee tɔ̈ në ER yic, ke p24 ee rot mat kenë Gas1-GFP, ke akuɔ̈tnhïïm juëc wääc yiic acïï bï ya cak. Kë yenë ye luɔɔi thïn ee rot gɛɛi në kä ye tïŋ ku kä ye kek yök në aciëëk ke ceramide yiic. Puɔ̈ɔ̈c cï looi në kä cï kek looi në kɔc cin acï yen bɛ̈n nyuɔɔth ke na cɔk ya tɔ̈ ke bäär apɛi (C24) ku jɔl ya kä thii kɔ̈k (C18-C16) ke ka lëu bïk käŋ ya tek yiic, ke kä bäär apɛi (C24) yenëke kä lëu bïk röt ya dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n ago cinema bɛɛr ya looi. Në thööŋ de thööŋ (17, 37, 38). Acï ya nyuɔɔth ke TMED2, man ye raan thöŋ kenë Emp24, ee ya luui në C18 në thɛɛr ke tɔ̈c yiic (39). Në luɔɔi de thööŋ de kä ye röt waar (MD), ɣok acï yök ke C18 ku C26 aye röt määt në ɣän ke Emp24 yiic, ku kaa nɔŋ kä thöŋ ye kek nhiaar (Thöŋ S6). Alëu bï ya ŋic ke wɛ̈t kän ee yen nyuɔɔth ke helix de Emp24 alëu bï lipids ya tek yiic në pïu yiic. Yekënë ee kë cï bɛ̈nbei në thɛɛr cï tëëk yiic cï rot gɛɛi në käke läi. Kä thöŋ ke MD aye nyuɔɔth ëya dɛ̈t ke nɔŋ kä ye röt looi në pïu yiic (40) . Ku na yïn ya, ke ɣok aye jam lɔn ye C26 tɔ̈ në ER26 yic kaarou tɔ̈ në thɛɛr juëc yiic. Na ye GPI-AP tɔ̈ në p24 yic ku mɛ̈ɛ̈të yic de C26 ceramide në p24 lɔ̈ɔ̈m në cytoplasmic yic, ke ka lëu bï mïïth ya cɔk määt röt ku bïk ya tɔ̈ në cin yiic (41), ku kän ee GPI-AP cɔk tek rot në ɣän juëc yiic. ɣän ke ER mëmbrënë (42). Kä cï ke lueel wënthɛɛr aacï ajuɛɛr cï lueel kuɔɔny (43, 44). Käjuëc ye röt mat në käm yiic, käm ye tuanytuɛɛny bɛ̈i, ka käm ye guöp gël në käm yiic (GSL) në plasma yic, ee GSL dït apɛi cɔk bɔ̈ nhial, ku ye käŋ tek yiic ku ye käŋ cɔk riääk ku yekë käŋ cɔk tɔ̈ thïn (44). Iwabuchi etc. (43) Acï yök ke tɔ̈u de kä bäär (C24) ku ka cie kä thii (C16) ke acyl, ke kä juëc cï röt rek kenë GSL lactosylceramide aye akuɔ̈tnhïïm juëc cɔk loi röt ku bïk röt ya tääu në käŋ yiic, ku jɔl ya käjuäc ye kek yök në tiim yiic.
Në läi yiic, ke tɔ̈c de tɔ̈c de tɔ̈c de Golgi (TGN) agut cï tɔ̈c de tɔ̈c de tɔ̈c tɔ̈ nhial ee tɛ̈ŋ de yic ku tɛ̈ŋ de yic de GPI-AP mac (10, 45). Kë cï määt yic kënë ee rot looi në GPI-AP (36), ku ka lëu bï ya pëk ëyadɛ̈ në bɛ̈ɛ̈r de thäm de ceramide ye ɣok yök në yeast yic. Na cɔk ya tɔ̈ ke GPI-AP de läi nɔŋ kë ye kek tääu në pïu yiic, ku tɛ̈n yenë kek tɔ̈ thïn ee wuɔ̈ɔ̈c apɛi kenë pïu dït apɛi ke acyl chain ceramide, ku puɔ̈ɔ̈c cï piac looi acï bɛ̈n yök ke pïu kedhiɛ aye naŋ käjuëc thöŋ në gupken yiic ku jɔl ya luɔɔiden (40). Ku na yïn ya, ke biäk de ether lipid tɔ̈ në käm yiic alëu bï ya thöŋ kenë biäk de C26 tɔ̈ në yeast yic, ku luɔɔide ee bï ya thiääk kenë biäk de miök tɔ̈ në pïu yiic ago GPI-AP ya määt ku bï ya tek yiic. Na cɔk ya ŋoot ke wïc bï ya them apath, ke kä cï kek yök wënthɛɛr aye jam në kë cenë acyl chain ceramide ya lɛɛr në guöp de Golgi yic, ku ka ye pëk në tɛ̈n yenë GPI rot luɔɔi thïn cïmën de yeast. Ku na yïn ya, ke tɛ̈n yenë käŋ röt luɔɔi thïn acï bɛ̈n ya tïŋ ke lëu bï käjuëc ya caath në dhöl töŋ kënë yic.
Në yeast ku jɔl ya läi yiic, ke GPI-AP ee rot määt ku bï rot tek yic tënë mïïth kɔ̈k peei ke plasma yiic, ku ka ye röt looi ke këc ɣet në cell yiic. Pälädïnö ku al. (48) acï yök ke TGN de ​​kä ye tɔ̈ në läi yiic, ke GPI-AP ee rot mat në tɛ̈n yenë GPI-APs tek yiic në pïu yiic, ku ka ye akut de GPI-APs ku jɔl ya luɔɔideen ye kek looi ya mac ëyadɛ̈. Tënë nhom de cell. Në yeast yic, ke puɔ̈ɔ̈c kënë acï nyuɔɔth ke akut de GPI-AP tɔ̈ në ER yic alëu bï akut de GPI-AP ya mac apath ku jɔl ya luɔɔi de GPI-AP në plasma yic (24, 49). Cït mɛn de ye löŋ kënë, käke GhLag1 aye tɔ̈u ke cïn kë ye keek gël tënë kä ye GPI gël wala wal ye käke guɔ̈p riɔ̈ɔ̈k (28), ku kë kɔɔr de luɔɔi de Gas1-GFP (49) de tip ceramide cï tïŋ në tɔ̈c de käke yeast ee G nyuɔɔth. Awuɔ̈c de GPI-AP. Ku na yïn ya, ke thëm dɛ̈t peei bï ya looi agonë ​​akuɔ̈tnhïïm ke luɔɔi de cell ya guiir në ER yic në dhöl yenë kek tek yiic cïmën de bɛ̈ɛ̈r de lipid, abï ya kë bï ya wïc në akälciɛ̈ɛ̈n yiic.
Kä ye kek luɔ̈ɔ̈i në ye luɔɔi kënë yic aacï kek gɔ̈t në Table S1 yic. MMY1583 ku MMY1635 ke SCLIM tënë thura de kä pïr acï kek looi në W303 cök. Käk ye Sec13-mCherry nyuɔɔth kenë mïïth ye lac yök në pïu yiic aacï kek ya looi në dhöl yenë pFA6a yök ke ye kë yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ (23). Kä ye Mid2-iRFP nyuɔɔth cï kek gɔ̈t në mïïth ye mac në GAL1 cök acï kek ya looi cïmën de. Ajuɛɛr de PCR de iRFP-KanMx tënë pKTiRFP-KAN vector (miɔ̈c de E. O'Shea, namba de plasmid de 64687; Nawën cenë Mid2-iRFP ya cɔ̈kpiny ku bï kek ya cak në GAL1 yic, ke ka cï bɛ̈n ya tääu në Not I-Sac I yic ago pRS306 ya määt. Kë cï bɛ̈n bei thïn ee pRGS7 cï tääu në Pst I yic ago rot ya mat në URA3 yic.
Kë ye cɔl Gas1-GFP ee rot looi në gël de GAL1 yic në plasmid yic (CEN), man ye looi cïmën de. Ajuɛɛr de Gas1-GFP acï bɛ̈n juak në PCR yic tënë pRS416-GAS1-GFP plasmid (24) (miɔ̈c de L. Popolo) ku cak kek në ɣän ke Xma I–Xho I ke CEN plasmid pBEVY-GL LEU2 (miɔ̈c de C). Mïlër; Namba de pläsmïd ë 51225; 51225; RRID: Adjëgnë_51225). Kë cï bɛ̈n bei thïn acï cɔl pRGS6. Axl2-GFP ee rot looi ëyadɛ̈ në gël de GAL1 ye pBEVY-GL LEU2 cɔk loi rot, ku yïknhial de yen ee kë cït kën. Ajuɛɛr de Axl2-GFP acï bɛ̈n juak në pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) në PCR, ku cï kek cak në Bam HI-Pst I de pBEVY-GL LEU2 vector. Kë cï bɛ̈n bei thïn acï cɔl pRGS12. Tɛ̈n yenë käjuëc tɔ̈ thïn ya luɔɔi thïn në ye puɔ̈ɔ̈c kënë yic, acï kek ya gɔ̈t në Table S2 yic.
Kë cï yök acï juak thïn në 0.2% de adenine ku 2% de glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% de pïu ë pïu ë p (YP) ë pïu ë pïu yiic (1 % ë pïu ë pïu yiic ku 2% ë pïu yiic ept). (YPR)] wala 2% de aliir [YP-liir (YPG)] cït mɛn yenë aliir yök thïn, wala në kë cï looi në kë thiin koor yic (0.15% de miök de miök ku 0.5% de miök de pïu) bï kä thöŋ ke amino acids ku kä kɔɔr keek në cäm yic juak thïn, Ku nɔŋic 2% de aliir dït wala glucose ( (kä cï looi ke galactose koor) ke ye tën bïï käbon thïn.
Në thɛɛr ke thura yiic, ke cells ye röt waar ke sec31-1 ye tɔ̈ në GAL1 cök aye kek cil në YPR yic në 24°C në wakɔ̈u agut cï thɛɛr ciɛɛl ke log. Na cï YPG tääu në 24°C yic në thaa 1, ke cells aacï kek ya tääu në SG yic në 37°C në minit kaa 30, ku ka cï kek ya tääu në 24°C yic agokë ya jäl në thɛɛr ke tɔ̈ɔ̈u yiic. Concanavalin A acï luɔ̈ɔ̈i bïnë kä cï röt looi tääu në kë yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ kɔ̈u ku bï thuur në SCLIM. SCLIM ee kë cï mat kenë Olympus IX-71 yenë käŋ tïŋ në kä thiik yiic ku UPlanSApo 100×1.4 yenë käŋ tïŋ në miök yic (Olympus), kë ye lac kat ku kë ye käŋ nyuɔɔth-tënë-awɔɔu ye rot wïïc në kë ye käŋ tïŋ në käŋ yiic (Yokogawa Electric ku ajuɛɛr cï looi në kä ye käŋ tïŋ yiic), kën yenë käŋ tïŋ në raan dɛ̈t peei. (Këde Ajuɛɛr) alë bï ajuɛɛr de kä ye daai dït bɛ̈i keke kën dït de akër de ×266.7 ku kën yenë käŋ thuur cï mat ke kä ye käke karaba juak (Ajuɛɛr de Ajuɛɛr de Ajuɛɛr) (21). Mɛ̈c de thura aye looi në këde aliiric (Yokogawa Karaba). Në thuraa ke 3D yiic, ɣok acï kë ye cɔl piezoelectric looi bï kë ye tïŋ cɔk riääk në dhöl tɔ̈u nhial, ku määtku biäk ke optical 100 nm ke wääc në kë cï määt yic. Thura de Z-stack aye waar yic ke ye wël ke 3D voxel, ku luɔɔi de të yenë käŋ tɛkpiny yenë käŋ tïŋ thïn yenë käŋ tïŋ në käŋ yiic në kë yenë käŋ tïŋ në käŋ yiic (PerkinElmer). Në luɔɔi de käke aliiric ke Volocity bï kä ye röt looi yetök ke cɛɛth de ɣän tɔ̈u kek thïn, ERES nɔŋiic käke cäth acï them. Cɛɛth de thëm de thëm acï looi ke luui käke luɔi de MetaMorph (Kë yenë käŋ looi).
Luɔ̈ɔ̈i ë kë ye cɔl GraphPad Prism bï kë thiekic de kuɛ̈n yök. Në t-thëm de Mïth ke Thukul nɔŋ nhïïm kaa rou ku thëm de dhöl töŋ de thëm de kä wääc (ANOVA), wuɔ̈ɔ̈c në kaam de akuut aye yök ke nɔŋ kë thiekic ye looi në P <0.05 (*).
Në kë de kä thi kor ke Gas1-GFP, ke kä thi kor ke log phase aacï kek ya cil në akɔ̈l tökic në YPD yic ku ka cï kek ya määt yiic në pïu yiic, ku ka cï kek ya waak në door yiic kaarou në pïu yiic, ku ka cï kek ya tääu në pïu yiic në minit kaa 15 yiic, ku ka cï kek ya lɔ tueŋ në kë yenë käŋ tïŋ yiic cïmën cenë ye lueel wënthɛɛr (Check42). Kë yenë käŋ tïŋ në kä thiik ke Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) cï tääu në kë yenë käŋ tïŋ yiic, L5 (GFP) yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ, kë ye käŋ thuur de Hamamatsu ku jɔl ya kë yenë käŋ looi në käŋ yiic. .
Kä cï them aacï keek waar keke kë cï them de SDS tën 65°C në minit kaa 10, ku jal keek tek thook në SDS-kë cï them de kë ye nyuɔɔth (PAGE). Në këde cɛɛth de käke guɔ̈p, 10 μl de kä cï them aacï keek tääu në dhöl tökic. Kë tueeŋ yenë käm gël: Luɔ̈ɔ̈i ë käm ye aliir rac në biäk de 1:3000, käm ye Emp24 gël në ciin de 1:500, ku jɔl ya käm ye GFP (miɔ̈c tënë H. Riezman) në ciin de 1:300. Raan ye cɔl Pgk1 acï bɛ̈n ya luui në ciin de 1:5000 (man cï gäm raan cɔl J. de la Cruz). Kë ye guɔ̈p gël: Kë ye guɔ̈p gël në thɔ̈k (HRP) cï mat kenë thɔ̈k ye guɔ̈p gël në thɔ̈k (IgG) yenë luui në pïu yiic në 1:3000 (Pierce). HRP-cï mat ke thɔ̈k ye thɔ̈ɔ̈r ke col IgG acï luɔ̈ɔ̈i në pïu cï liääp ke 1:3000 (Kë cï thɔ̈ɔ̈ŋ). Të yenë guɔ̈p gël thïn acï tïŋ në kueer yenë käŋ tïŋ në kë yenë käŋ tïŋ në piny ciɛɛm de Pico (Kë ye cɔl Thermo Fisher Scientific).
Cit mɛn cïnë ye lueel në (31), käke thëm de käke guɔ̈p cï röt looi acï looi në bak de ER cï juak yic. Në wël lik yiic, ke yï lɔɔk ë pïu yiic në pïu yiic në pïu yiic [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM pïu ë pïu yiic ku pïu ë pïu yiic ë pïu yiic) në 600 nm (OD600) në thɛɛr kaa rou yiic. Acï dhuɔ̈ɔ̈ŋ në pïu ke glass, ku jal yaa kä cï riääk ke cell ku pïu ke glass aacï keek nyaai në pïu ke glass. Kë cï bɛ̈n bei thïn acï tääu tëde 17,000 g në minit kaa 15 në 4°C. Pellet acï bɛɛr tääu në TNE yic ku kën acï mat thïn në thök de 1%. Kë cï tääu thïn acï tääu në thaa tökic ke rot wïïc në 4°C, ku kä cïï lëu bïk thök aacï keek nyaai në 13,000 g në 4°C në minit kaa 60. Në këde aliir yenë käŋ gël, ke ka kɔn tääu në kä cï kek them yiic në 4°C në thaa tökic, ku jɔl ya tɔ̈ɔ̈u në 4°C në thɛɛr kaa 3 yiic. Kä cï kek tääu në pïu yiic aacï kek ya lɔ waak në thɛɛr kaa dhiëc yiic kenë TNE nɔŋic 0.2% de digoxigenin, ku ka cï kek ya nyaai në SDS, ku ka cï kek ya tek yiic në SDS-PAGE, ku ka cï kek ya caath në dhöl yenë kek yök.
Cit mɛn cïnë ye lueel në (31), thööŋ de kä cï röt rek acï looi në bak de ER cï juak yic. Në wël lik yiic, ke biäk de ER cï juiir acï tääu në 0.5 mM de dithiobis (kë cï yök në pïu yiic) (Pierce, 20°C, 20 min). Kë cï röt rek acï thök në juɛ̈ŋ de glycine (50 mM thök de thök, minit ka 5, 20°C).
Cït mɛn cïnë ye lueel wënthɛɛr (50), MS acï thëm de kä ye yök në tiim yiic ku GhLag1 acï looi. Në wël lik yiic, ke kä cï kek yök aacï kek ya cil në thɛɛr juëc yiic (3 agut cï 4 OD600 në ml) në YPD yic në 30°C, ku kä cï kek yök në 25×107 yiic aacï kek ya yök. Kä ye kek cam në mïïth yiic aye kek cɔk thök në pïu yiic. Luɔ̈ɔ̈i ë kë ye käŋ miɛ̈tbei [ëthanöl, pïu, ether, pïrïdïn ku 4.2 N ammöniuum hïdröxïdë (15:15:5:1:0.018 v/v)] ku 1.2 nmol de kë tɔ̈u thïn ë thäät yiic ë C17 ë thäät yiic (860517, Avanti polar lipïd) ë piath). Luɔ̈ɔ̈i ë kën ë pïu ë pïu, pïu, n-bɛ̈t ku pïu ë pïu (4:3:1:5 v/v)] bï pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu. Në thök, ke kë cï bɛ̈ibei acï bɛɛr tääu në kë puɔth yenë käŋ liääp [klöröform/mëthänöl/pïu (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] ku tɛ̈ɛ̈uë në kë yenë käŋ them yiic. Käjuëc ye röt looi (MRM) acï kek ya looi agonë ​​käjuäc ke sphingolipid ya ŋic ku bï kek ya them. Kë ye cɔl TSQ Vantage yenë käŋ tïŋ në käŋ yiic (Kë ye cɔl Thermo Fisher Scientific) acï tääu në adit yenë käŋ cath në pïu yiic cɔl Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) agonë ​​lipid ya caath. Riɛl de rɔ̈mpiny aye looi tënë ayi akut de ceramide. MS data acï yök në dhöl puɔth. Në dhɔ̈l ke pïïr yiic kedhiɛ, ke lipid ee ya ciɛɛl de käŋ kaadiäk ye kek them.
Cïmën cenë ye lueel në (31) yic, ke käm (800×107) ye Gas1-GFP nyuɔɔth aake cï kek ya tääu në kä ye röt looi yiic. Gas1-GFP cï juiir acï tek thook në SDS-PAGE ku lɛɛr tën kë ye cɔl PVDF. Kä ye cam aye kek tïŋ në tɛ̈ɛ̈u ë PVDF në kë col de amide. Gas1-GFP acï tɛ̈ɛ̈m bei në PVDF yic ku lɔɔk në thɛɛr kaa 5 keke pïu ke pïu ke pïu ke pïu ke MS (LC-MS). Na tɛ̈ɛ̈uë ë pïu yiic në 500 μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), kë ye pïu liääp ku 500 μl cï liääp ke 1 M në pïu yiic në 37°C në thɛɛr kaa 3 yiic, ke biäk de lipid ee jäl në kaam de Gas1-GFP ku jɔl ya pïu yiic në kaam de pïu yiic. (51). Në ye kënë cök, ke pïu cï kek tääu në pïu yiic aacï kek ya lɔɔkic në thɛɛr kaaŋuan yiic në pïu ke LC-MS yiic, ku ka cï kek ya tɔ̈ɔ̈u në aliir de nitrogen yic në -80°C agut cï bï kek ya caath. Ke ye kën mac, kën cïn kë tɔ̈u thïn de PVDF acï luɔ̈ɔ̈i tën kë them abɛ̈n. Lipid cï bɛ̈ibei tënë Gas1-GFP acï bɛ̈n ya caath në MS cïmën cenë ye lueel (50). Në wël lik yiic, ke PVDF cï tääu në pïu yiic nɔŋic GPI-lipid aacï kek bɛɛr tääu në 75μl de pïu yiic [1:2) + 5 mM ammonium acetate] ku ka cï tëëk në pïu yiic (ESI)-MRM/MS Cɛɛth de pïu yiic (TSQ Vantage). Në ye kën yic, wël ke MS aacï keek yök në dhöl de ion cie yic.
Cït mɛn cïnë ye lueel wënthɛɛr, ke biäk de lipid de GPI acï tek yic tënë [3H]-ïnositol cï gɔ̈t në GPI-AP (16). Kä cï liääp ke pïu yiic aacï kek ya tek thook në ajuiɛɛr yenë käŋ liääp yiic (55:45:10 në pïu yiic) ku ka cï kek ya tïŋ në FLA-7000 (Fujifilm).
Kä ye Gas1-GFP (600×107) nyuɔɔth aacï kek ya lɔ waak në door yiic kaarou kenë TNE, ku ka cï kek ya tɛk në pïu yiic, ku ka cï kek ya tääu në pïu yiic ago kä cï riääk ya nyaai. Kë cï bɛ̈n bei thïn acï tääu në 17,000 g yic në thaar tök në 4°C. Pellet acï lɔɔk në TNE yic ku tɛ̈ɛ̈uë në 1 U PI-PLC (Invitrogen) në TNE yic nɔŋic 0.2% de pïu cï keek tääu në pïu yiic në thaa tök në 37°C. Na cï tɔ̈ɔ̈u de enzyme thök, ke tɔ̈ɔ̈u de pïu acï nyaai në tɔ̈ɔ̈u de 17,000 g në 4°C në thaa 1. Ago aliir cɔl Gas1-GFP ya gël, ke kë cï döŋ piny acï ya tääu në aliir yic në 4°C në wakɔ̈u. Gas1-GFP cï juiir cï tek thook në SDS-PAGE acï tääu në pïu yiic ke Coomassie. Kë cï tääu në Gas1-GFP yic acï tɛ̈ɛ̈m wei në kë ɣer cï pïu gɔ̈lpiny, ku të cïnë ye tääu në pïu yiic ku tɛ̈ɛ̈uë yen piny në pïu yiic, ke pïu cï liääp kenë trypsin acï bɛ̈n looi. Tɛ̈u ë pïu yiic ku pïu yiic ku pïu yiic kenë GPI-glycans. Peptide cï riɛl acï tääu në 20 μl de pïu yiic. Tääu ë thäät (8μl) në LC yic. Kë cï looi në mɛ̈c yic (ODS) acï looi bï kä cï röt looi tek thook në kä cï röt looi yiic. Kë cë jäl ë thäät yiic ee kën ë thäät A (0.08% ë thäät ë thäät) ku kën ë thäät B (0.15% ë thäät ë thäät ë 80% ë thäät ë thäät). Ajuɛɛr de HPLC cï looi (Aciëŋ de Käke Raan, Boston, Massachusetts) acï luɔ̈ɔ̈i bïnë kë cï liääp A nyaai në minit ka 55 yiic në thëm de 50 μl min-1 në minit kaa 5, ku jal yaa kë cï liääp B acï juak agut cï 40%. , Paan de Amerika). Kë cï bɛ̈n bei thïn acï lɔtueŋ ke tääu tën bïï ESI ion thïn, ku käke thëm ku käke thëm kenë GPI-glycans aacï keek caath në LTQ Orbitrap XL (kë cï liääp ke thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm). Në MS ë tɛ̈ɛ̈u yic, ke pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë 4.5 kV, ku pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë 300°C. Aciëŋ de pïu ë pïu yiic ku pïu ë pïu yiic aacï keek tääu në 15 V ku 50 V, në tök. MS wël aacï keek yök në dhöl de ion puɔth (thëm de 60,000; thëm de thëm de 10 në mïlïön tökic) në thëm de thëm de 300/m/z thëm de thëm/thëm de thëm (m/z) 3000. thɔ̈ɔ̈r ë thɔ̈ɔ̈r ë thɔ̈ɔ̈r (CID)].
MD thööŋ acï looi në luɔɔi de GROMACS (52) ë thäät ku MARTINI 2 ë thäät ë thäät (53-55). Kë ye cɔl CHARMM GUI ye käŋ yïk (56, 57) acï bɛ̈n luui në yen agonë ​​käŋ kaarou ya yïk ku jɔl ya Cer C18 ka DOPC ku jɔl ya Cer C26. Të tɔ̈u yen thïn ku thööŋ de Cer C26 aye keek yök tënë DXCE në nyaai de kä juëc tɔ̈u në yɔ̈l de kë cït kën yic. Luɔ̈ɔ̈i ë ajuɛɛr cï lueel piiny ëtënë bï thëm de käŋ kaa rou thɔ̈ɔ̈ŋ ku mac, ku luui ë thëm de thök de ajuɛɛr bï ajuɛɛr nɔŋic Emp24 yïk. Kë ye cɔl yeast Emp24 (kä cï döŋ piny ke 173 agut cï 193) acï looi ke ye α-helix në luɔɔi de MD (VMD) yenë käŋ tïŋ (58). Ku, të cïnë lipids cï röt määt nyaai, ke mïïth acï kek bɛ̈n ya tääu në biäk de CHARMM GUI yic. Ajuɛɛr de akër anɔŋic 1202 DOPC ku 302 Cer C26 wala 1197 DOPC ku 295 Cer C18 ku Emp24. Tääu ë ajuɛɛr yic në 0.150M. Käŋ kaaŋuan cï kek dhuɔ̈kpiny acï kek ya looi në bilayer kaarou yiic.
Lipid bilayer ee thɔ̈ɔ̈ŋ në luɔɔi de CHARMM GUI, man ye tɔ̈ ke ye thɔ̈ɔ̈ŋ de 405,000 ë dhɔ̈l, të yenë kä ye tɔ̈ thïn thɔ̈ɔ̈ŋ ku thɔ̈ɔ̈ŋë keek, ku dhɔ̈l ke thaa aye juak në 0.005 ps agut cï 0.02 ps. Na cï käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ, ke ka ye 6 μs bɛ̈i bei në thɛɛr ke 0.02 ps. Na cï Emp24 tääu thïn, ke yïn luui ë dhöl töŋ de CHARMM GUI bï yïn nhom ya tääu piny ku thɔ̈ɔ̈ŋë dhöl ë luɔi, ku jɔl ya jäl në 8 s në luɔi yic.
Në ajuɛɛr ëbɛ̈n, në thɛɛr ke thööŋ, aliir aye mac në Berendsen (59), ku në thɛɛr ke luɔi, aliir aye mac në Parrinello-Rahman (60). Në käŋ yiic kedhiɛ, ke aliir tɔ̈ ciɛɛl ee 1 bar ku aliir tɔ̈ ciɛɛl yenëke aliir määt yiic yenëke luui në yen. Në thööŋ ku ajuɛɛr de luɔi, kën yenë atuɔ̈c tääu (61) kenë thëm de thëm de thëm de thëm ee luui bï thëm de thëm de mïïth, lipid ku kä ye pïu cɔk tɔ̈u thïn määt yiic. Në thɛɛr ke luɔi ëbɛ̈n, ke thëm de thëm de thëm ee 310K. Kä cïï röt ye rek aye kek yup në luɔɔi de ajuiɛɛr de Verlet kenë 0.005 yenë käŋ gël. Wɛ̈t cɔl Coulomb aye yup ke luui tën kë ye rot looi ku kaam cï tɛ̈ɛ̈m 1.1 nm. Wɛ̈t cɔl Vander Waals ee ajuɛɛr de tɛ̈ɛ̈m de käŋ luɔ̈ɔ̈i kenë kaam de tɛ̈ɛ̈m de käŋ ye 1.1 nm, ku ajuɛɛr de tɛ̈ɛ̈m de käŋ de Verlet ee luui në kë lëu bï rot gɛɛr (62).
Në luɔɔi de VMD, ke thëm de thëm de pïu tɔ̈ në kaam de DOPC ka thëm de AM1 ku mïïth ke mïïth ee 0.7 nm, ku ciin de mïïth ye tɔ̈ në mïïth yiic aye yup. Cït tɛ̈n cenë ye luɛɛl thïn në wël cï kek lueel yiic, ke yï yup ë thëm de thëm de thëm (DE) cïmën de (63): thëm de DE = (ciin de lipid ëbɛ̈n tɔ̈ në mïïth yiic 0.7) në mïïth yiic 0.7 (ciin de Cer në mïïth yiic)
Kë cï lueel acï yök ke ye kën tɔ̈u ciɛɛl, ku kä cï röt wuɔ̈ɔ̈c aye käŋ kaa ŋuan tɔ̈u ë ke lääu ke SE. Kë thiekic de kuɛ̈n de DE aye yup në t thëm [(thööŋ de DE-kë-1)/SE]. Yup P ë thäät ë tɛ̈ɛ̈k ë tök.
Kë yenë GROMACS looi acï luɔ̈ɔ̈i bïnë 2D de thëm de piny yup de ajuɛɛr nɔŋic Emp24 në 250 ns cï lɔ ke thëm. Në kë bïnë thööŋ de dït/thök de ceramide yök, ke thööŋ de dït de Cer aye tek yic në thööŋ de thööŋ de Cer ku DOPC, ku ka ye tek yic në thööŋ de Cer në guɔ̈p yic. Thëm de kë ye piny nyuɔɔth de kïït thöŋ aye luɔ̈ɔ̈i.
Të wïc yïn käŋ juëc kɔ̈k ë athör kënë yic, ka yï tïŋ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1.
Yekënë ee kë cï gɔ̈t ë yök ë thok cï tɛkpiny në lööŋ ke Creative Commons Attribution-Cie-Kë-Cie-Kë-Cï-Kë-Tajir, ye puɔ̈l bï luui, tɛkpiny ku gɛ̈t-piny në gɛɛr de kueer, të cïnë luɔɔi de akër cie kën yök de tajiir ku kë tɔ̈u thïn ee naadɛ̈ ke luɔi thɛɛr ee yic. Wël ye ke lueel.
Tïŋ: Ɣok a wïc yïn ba athör duɔ̈ɔ̈n ë gɛ̈tgɛ̈t tääu-pïny rin bï raan ë gɛ̈tgɛ̈tdu tääu-pïny ŋic lɔn wïc yïn keek bïk gɛ̈tgɛ̈t tïŋ ku lɔn cie gɛ̈tgɛ̈t ë gɛ̈tgɛ̈t. Wek aacïï bï lööŋ ke email dɔm.
Kë thiëc kënë aye looi bï yïn them lɔn yïn ee raan ë yök ku gël ë thäät ë thäät ë thäät.
Söfïä Rödrïgëz-Gällardö, Kazuö Kurökawä, Susäna Säbïdö-Bözö, Alëjandrö Cörtëz · Gömëz (Alëjandrö Cörtës-Gömëz), Atsukö Ikëda (Atsukö Ikëda), Välërïa Zönï (Valërïa Zönï), Auxilïadöra Wägïlërä-Römërö (Anä Märäïa Përëzë Mïrgïö Mïrgïgözë). Wäga), Mïsäkö Ärmän (Mïsäkö Rïmän), Pröw Äkïrä, Stëfänö Fänny, Akïhïkö Nakanö, Mänuël Münïz
Thura de 3D ye lac tïŋ në thaar yic ee piath de bɛ̈ɛ̈r de ceramide nyuɔɔth tënë kä ye cam në ɣän cï keek kuany yiic.
Söfïä Rödrïgëz-Gällardö, Kazuö Kurökawä, Susäna Säbïdö-Bözö, Alëjandrö Cörtëz · Gömëz (Alëjandrö Cörtës-Gömëz), Atsukö Ikëda (Atsukö Ikëda), Välërïa Zönï (Valërïa Zönï), Auxilïadöra Wägïlërä-Römërö (Anä Märäïa Përëzë Mïrgïö Mïrgïgözë). Wäga), Mïsäkö Ärmän (Mïsäkö Rïmän), Pröw Äkïrä, Stëfänö Fänny, Akïhïkö Nakanö, Mänuël Münïz
Thura de 3D ye lac tïŋ në thaar yic ee piath de bɛ̈ɛ̈r de ceramide nyuɔɔth tënë kä ye cam në ɣän cï keek kuany yiic.
©2020 Akutnhom de Kɔc ke Amɛrika de Käke Luɔɔi. lööŋ kedhiɛ aacï keek tɔ̈ɔ̈u. AAAS ee partner de HINARÏ, AGORA, OARË, CHORUS, CLOCKSS, CROSSREF AND COUNTER. Lɔtueŋ de Nyïc ISSN 2375-2548.