Tënë ëmën *Tënë tɔ̈u yen thïn ëmɛɛn: Kölön 50931, Germany, Akutnhom de Käk Pinynhom ë Rïthäc në Käk ë Tɔ̈ɔ̈u ë Tɔ̈ɔ̈u ë Tɔ̈ɔ̈u ë Dhiëth (CECAD).
Tɛ̈ yenë tuanytuɛɛny ke mitochondrial riääk në guöp yic, aye yök ke cïï lëu bï rot dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n në kë cenë nhom ya tɔ̈ ke cie lac luui apath, ku kë ye rot looi në nhom yic ee kë cïï rot ye lac looi në guöp yic. Ëtënë, ɣok acï käke pïïr ke Purkinje bɛ̈n nyuɔɔth kenë OXPHOS ye lac yök në kë cenë käjuëc ke pïïr ya riɔ̈ɔ̈kic. Acuk yök ke luɔɔi de mitochondrial ee käjuëc wääc yiic bɛ̈i në baŋ de proteomics yic, man ye luɔɔi de mïïth cɔk loi röt ke cell këc thou. Ke këc thɔ̈ɔ̈ŋ, ɣok acï yök ke tɔ̈u ke ŋic ë tɔ̈u ë pyruvate carboxylase (PCx) ku kä kɔ̈k ke gël de dït ë nhom ye kä tɔ̈ ciɛɛl ke TCA gël. Tɛ̈ yenë PCx gël thïn ee nhom cɔk riääk ku bï nhom ya riääk, ku kän ee yen nyuɔɔth ke tuany ë nhom ee naŋ kë ye nhom gël në nhom cïn yic OXPHOS. Dhukciɛ̈ɛ̈n de mitochondrial në neurons cï riääk yiic ee aciëëk ke metabolism dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n, ku ye thon de cell gël. Kä cukku kek yök aye dhɔ̈l ëke këc kek ya ŋic wënthɛɛr ya nyuɔɔth agonë ​​mitochondrial ya cɔk tɔ̈ ke cïï lui apath ku yekë nyuɔɔth ke tɔ̈ɔ̈k de nhom alëu bï ya dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n agut cï të cenë tuany thök.
Luɔɔi ciɛɛl de mitochondria në gël de riɛl de nhom yic ee rot lac looi në käjuëc ke nhom ye thiääk kenë tuanytuɛɛny ke mitochondria ke raan. Käjuëc ke tuanytuɛɛny käkë aye bɛ̈n në gɛ̈ɛ̈r de käŋ yiic ye guöp cɔk ril (1, 2) ka riääk de käŋ thiääk kenë pïïr de guöp, man ye tɔ̈c de DNA (mtDNA) riɔ̈ɔ̈k (3, 4). Luɔɔi cï looi në läi yiic acï ya nyuɔɔth ke tɛ̈n cenë mitochondrial ya luui apath në räl thiääk kenë yen yiic, ke dhɔ̈l ke metabolic (5-7) alëu bïk ya luui, man ye wël thiekiic bɛ̈i agonë ​​tuanytuɛɛny riliic käkë ya deetic apath. Në thööŋ de käŋ yiic, ke tɛ̈n yenë käŋ röt waar thïn në käjuëc ke cell yiic, man ye rot looi në kë cenë nhom de raan ëbɛ̈n ya luui apath (ATP) ee kë thiekic apɛi (8), ku ye kë wïc bï ya yök në dhɔ̈l ke wal yiic agonë ​​tuanytuɛɛny ya gël ka bïk tuanytuɛɛny ya gël. Gël ë dhöl ë pïïr (9). Cïn wël ë yök ee yic lɔn ye nerve cells yök ke nɔŋ kä lik apɛi ke metabolism të thööŋë kek kenë cells tɔ̈ në räl thiääk kenë kek yiic (10). Në kë cenë kee käkë ya luui në luɔɔi thiekic apɛi agokë kä ye kek cam ya cɔk lɔ tueŋ apath ku bïk kä cï röt wuɔ̈ɔ̈c ku tuanytuɛɛny ya dhuknhïïm, ke tɛ̈n lëu benë käjuäc ya cɔk lɔ tueŋ apath në kä dhal kɔc yiic në nhom yic, ee ya kë thiin koor ye tɔ̈ në glial cells yiic (11-14). Në yekënë kɔ̈u, ke tɔ̈c de räl ke nhom ee puɔ̈ɔ̈c de kä ye röt waar në mïïth yiic ye röt looi në akuɔ̈tnhïïm thi kɔ̈k ke neuronal yiic riɔ̈ɔ̈kic. Kë cï bɛ̈nbei thïn, ee kë thiin koor ŋic në kë de kä ye röt looi në räl yiic ku jɔl ya kä ye röt looi në thɛɛr ke tɔ̈c yiic.
Ku bï kä ye röt looi në thɛɛr ke tɔ̈c yiic ya deetic, ke ɣok acï tɔ̈c de Purkinje (PNs) ya tek thook në ɣän wääc yiic ke tɔ̈c ye bɛ̈n në riääk de tɔ̈c de nhom yic (Mfn2). Na cɔk Mfn2 ya tɔ̈ në kɔc yiic ya thiääk kenë tuanytuɛɛny ke nhom ye cɔl Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), ke riääk de Mfn2 në cuɔl yic ee kë ye lac ŋic ke ye luɔɔi de OXthoPHOS. Kä juëc ke nhom (16-19) ku kä ye bɛ̈n bei thïn ke nhom aye cath kenë kä ye nhom cɔk lɔ tueŋ, cïmën de tɔ̈ɔ̈k de cäth (18, 19) ka tɔ̈ɔ̈k de nhom (16). Në luɔɔi de mɛ̈ɛ̈t de kä cïn kë ye kek gɔ̈t (LFQ) ke mïïth, kä ye röt waar, thura, ku jɔl ya dhɔ̈l ke puɔ̈ɔ̈c de käm, ke ɣok aye nyuɔɔth ke tɔ̈c de nhom ee tɔ̈c de nhom (PCx) cɔk loi rot apɛi ku jɔl ya kä kɔ̈k peei ye tɔ̈ në PNs yiic në vivo yic. Acän ba thiääk de kë cï yök kënë ya ŋic, ke ɣok acï PCx ya cɔk tɔ̈ piiny në Mfn2-deficient PNs yiic, ku yökku ke luɔɔi kënë ee kɔc cɔk riääk puɔ̈ɔ̈th ku ye nhom lac riääk, ku kän ee yen nyuɔɔth ke azoospermia ee cells cɔk thou agokë röt ya waar. Ajuɛɛr dït apɛi de MFN2 alëu bï PN cï riääk ya kony ke cïn OXPHOS dït apɛi, ku ye DNA dït apɛi cam, ku ye rot looi ke cï riääk, man ye ŋoot ke ye lueel ke ye dhöl de riääk de nhom kënë alëu bï rot ya dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n ke tuany këc rot guɔ jɔɔk.
Në kë bïnë mïïth ke Mfn2 knockout PNs ya tïŋ, ke ɣok acï mïïth ke mouse ya luɔ̈ɔ̈i ago mïïth ye lac tɔ̈ në Cre yic ya cɔk yök mïïth ye lac yök në mïïth yiic (YFP) (mtYFP) (20) Cre ye rot nyuɔɔth ku tïŋku tɛ̈n yenë mïïth tɔ̈ thïn ya tïŋ në vivo yic. Acuk yök ke riääk de Mfn2 gene në PNs yic abï tɛ̈ɛ̈k de kä ye röt looi amääth ya cɔk loi rot (Thiɛ̈ŋ S1A), ku wɛ̈ɛ̈r tueŋ acï yök në wiik kaa 3 yiic. Në thööŋ, ke thök de PN cell, cïmën cenë ye nyuɔɔth në määr de Calbindin, akëc rot jɔɔk agut cï wiik kaa 12 ke run (Thoŋ 1, A ku B). Thaar cïï thöŋ në kaam de kä cï röt lac waar yiic në thɛɛr ke tɔ̈c yiic ku jɔl ya thon de nhom cï tïŋ acï ɣok bɛ̈n cɔk thiëëc kä ye röt waar në thɛɛr ke tɔ̈c yiic ke cell këc thou. Ɣok acï dhöl ë tɛ̈ɛ̈k ë pïu ë pïu yiic (FACS) looi bï YFP (YFP+)-pN nyuɔɔth (Thöŋ 1C) ya tek thook, ku në pïu yiic ë pïu yiic (Mfn2 + / löxP :: mtYFP löxP- thök-löxP: : L7-cre), ëmɛn ye cɔl CT1BRL (Thöŋ). Cökpiny de dhöl de gël de ɣöt thok ee rot gɛɛi në riɛl de YFP ye nyuɔɔth ee ɣok puɔ̈l buk guɔ̈p de YFP+ (YFPhigh) de PNs ya lɔɔkic tënë kä cie PNs (YFPneg) (Thöŋ S1B) ka kä cï kek tääu në axon/dendritic yiic (YFPlow; Thura S1D, cï tääu në baŋ ciɛɛm). Në kë bïn ŋic de ciin de kɔc cï keek tek yiic, ɣok acï LFQ looi ku jɔl ya kä thiekiic ke thëm, ku yökku ke nɔŋ kë cï tek yic apuɔth në kaam de YFPhigh ku YFPneg (Thiɛ̈ŋ S1C). YFPhigh acï thök ë thök ë thök ë PNs ŋic (cït mɛn de Calb1, Pcp2, Grid2 ku Itpr3) nyuɔɔth (21, 22), ku acïn thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök (Thöŋ 1D) ). Thɔ̈ɔ̈ŋ de kä cï kek them në kä cï kek tek yiic ke YFPhigh cells cï kek määt yiic në kä cï kek ya them yiic acï ya nyuɔɔth ke nɔŋ kë thiääk kenë kek> 0.9, ye käpath ye kek dhiëëth ya nyuɔɔth në kaam de kä ye röt dhuɔ̈kpiny në kä pïr yiic (Thiɛ̈ŋ S1E). Në thökde, kee wëlkë acï ajuɛɛr da cɔk ye yic tënë acute ku tɛ̈ɛ̈k de PN lëu bï rot looi. Në kë yenë L7-cre ajuɛɛr de gɛ̈ɛ̈r ë riäth cï luɔ̈ɔ̈i ye mosaic bɛɛr määt në wik tueŋ wën cïnë meth dhiëëth (23), ɣok acï jɔk buk thɔ̈ɔ̈r ë thɔ̈ɔ̈r ë CTRL ku thɔ̈ɔ̈r (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP / loxP :: L7-cre) Kuɔ̈ɔ̈t ë nhom. Na cï thök ë määt, ka ye cɔl Mfn2cKO në wiik kaa 4 yiic. Cït mɛn de thök, ɣok acï wiik kaa 8 kuany ke PN layer tɔ̈u ke cïn kë cï riääk cɔk alɔn cïn yen kë nyic ke cï tɛ̈ɛ̈kic (Thiɛ̈ŋ 1B ku Thura S1A). Në thööŋ, ɣok acï thööŋ de 3013 de mïïth thɔ̈ɔ̈ŋ, ku 22% de kek aye tɔ̈ në MitoCarta 2.0 cï gɔ̈t në thööŋ de mïïth ke mïïth cït mɛn de mïïth ke mïïth (Thöŋ 1E) (Thöŋ 1E) (24). Cɛɛth wääc de gene cï looi në wik kaa 8 acï nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke 10.5% de mïïth kedhiɛ anɔŋ kä cï röt waar (Thoŋ 1F ku Thura S1F), ke mïïth kaa 195 aake cï keek tääu piny ku mïïth kaa 120 aake cï keek tääu nhial (Thoŋ 1F). Alëu bï ya ŋic ke “luɔɔi de dhɔ̈l yam ke thëm” de wël cï kek yök käkë aye nyuɔɔth ke dhɔ̈l wääc yiic ke genes aye ya tɔ̈ në akuɔ̈tnhïïm cï kek gël yiic ke dhɔ̈l ke metabolic (Thiɛ̈ŋ 1G). Kë ye kɔc miɛ̈t puɔ̈ɔ̈th apɛi, agut cï na cɔk dhɔ̈l thiääk kenë OXPHOS ku jɔl ya calcium ya cɔk tɔ̈ piiny, ke ka ye luɔɔi de mitochondrial cɔk loi rot në PNs yiic, ku akuɔ̈tnhïïm kɔ̈k peei ye amino acid ya cɔk lɔ tueŋ apath, man ye thiääk kenë luɔɔi de mitochdrion ye rot looi në PN yic. cïï lui.
(A) Thuraa ke tɔ̈u në nyin de nhom de CTRL ku Mfn2cKO yiic ye nyuɔɔth ke PNs cï lɔ tueŋ (calbindin, gray); nuclei aacï keek thɔ̈ɔ̈ŋ kenë DAPI. (B) Thööŋ de (A) (tök de dhöl de cɛɛth de kä wääc, ***P<0.001; n = 4 agut cï 6 cï gölic tënë cuɔl kaa diäk). (C) Luɔɔi de thëm. (D) Tɛ̈k-tɛ̈k de kä ye nyuɔɔth ke Purkinje (tënë nhial) ku kä kɔ̈k ke cell (cilic). (E) Thura de Venn ee ciin de mïïth ke mïïth cï kek yök në PN cï tek yic nyuɔɔth. (F) Kë cï yök në mac yic ye kä wääc ke mïïth ke Mfn2cKO në wiik kaa 8 (kë thiekic de 1.3). (G) Cɛɛth de dhöl de cak ee dhɔ̈l thiekiic kaa dhiëc ke lööŋ nhial (thith) ku lööŋ piny (blue) nyuɔɔth në Mfn2cKO PN cï tek yiic ke ye wiik kaa 8. Ciin ciɛɛl de mïïth cï kek yök aye kek nyuɔɔth. Kë ye nyuɔɔth de atuɔ̈c de thëm de gël: cï P thɔ̈ɔ̈ŋ. ns, acie kë thiekic.
Kä cï kek yök në mïïth yiic aye nyuɔɔth ke mïïth ye röt looi në I, III, ku jɔl ya IV yiic aye röt dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n amääth. Kä riliic ke I, III, ku IV aye naŋ kä thiekiic ke mtDNA cï keek tääu thïn, ku kä riliic ke II, man ye tɔ̈ ke cï keek tääu në nuclear yic yetök, acïï keek ye riɔ̈ɔ̈k (Thöŋ 2A ku Thura S2A). . Cïmën de kä cï kek yök në proteomics yiic, ke tɛ̈n yenë räl ke nhom gël thïn acï ya nyuɔɔth ke MTCO1 (ciin de räl ke räl ke 1) rïŋ de räl ke IV në PN yic ee rot dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n amääth (Thiɛ̈ŋ de 2B). Aciëŋ de mtDNA cï tääu në Mtatp8 yic acï bɛ̈n dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n apɛi (Thöŋ de S2A), ku tɛ̈n de ATP cï tääu në nuclear yic acï döŋ ke këc rot waar, man ye thöŋ kenë kë ŋic ke ATP cï tääu në F1 yic të cenë mtDNA rot ya tääu piny. Luɔɔi de yeen ee thöŋ. Gël (7). Cɛɛth de mtDNA në Mfn2cKO PNs cï ke tek yiic në thɛɛr ke thök yiic (qPCR) acï thök de mtDNA cɔk lɔ piny amääth. Të thööŋë yen ke akutnhom de gël, në wiik kaa 8 ke run, ke 20% de mtDNA ë tɔ̈ thïn yenë ka cï tɔ̈ɔ̈u (Thiɛ̈ŋ 2C). Cït mɛn de kä cï bɛ̈n bei kënë, kën yenë käŋ tïŋ në kä thiik yiic ke Mfn2cKO PNs acï luɔ̈ɔ̈i bï DNA yök, ye thaar yenë käŋ cam nyuɔɔth (Thiɛ̈ŋ 2D). Acï bɛ̈n yök ke kɔc kɔ̈k peei ye tɔ̈ në mïïth yiic ku jɔl ya tɛ̈n yenë kek yök thïn, kek aye kek mac apath, agut cï Lonp1, Afg3l2 ku jɔl ya Clpx, ku jɔl ya käjuëc ye kek määt yiic ke OXPHOS. Acïn kë dït cï rot waar në thɛɛr ke mïïth yiic ye tɔ̈ në apoptosis yic cï yök (Thiɛ̈ŋ S2B). Cïmën de, ɣok acï yök ke mɛ̈c ku mɛ̈c ke mɛ̈c ye tɔ̈ në gɛ̈ɛ̈r de calcium yic aye naŋ kä thiik ye röt waar (Thiɛ̈ŋ S2C). Në yekënë nhom, ke thëm de mïïth thiääk kenë mïïth ke autophagy acïn kë cï rot waar, man ye thöŋ kenë kä ye tïŋ ke mïïth ye lac cam cï kek ya tïŋ në vivo yic në thëm de kä ye kek lac cam yiic ku jɔl ya kä ye kek cam në kä thi kor yiic (Thoŋ de S3). Ku na yïn ya, ke luɔɔi de OXPHOS në PNs yic ee ya cath kenë käjuëc ye röt geer në ke yiic. Akutnhïïm ke mɛ̈c aye tïŋ në guɔ̈p de mɛ̈c yic ku në tiim yiic ke Mfn2cKO PNs nɔŋ run kaa 5 ku 8, ku tɔ̈c de mɛ̈c tɔ̈ thïn acï rot waar apɛi (Thiɛ̈ŋ S4, A ku B). Cït mɛn de kee kä cï röt waar käkë ku thök dït de mtDNA, cɛɛth de nhom de nhom dït apɛi kenë TMRM acï nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke nhom de nhom dït apɛi në Mfn2cKO PNs acï thök apɛi (Thoŋ S4C).
(A) Thɛɛr ke thëm de thëm de thëm de OXPHOS ril yic. Tïŋ ë mïïth ke P<0.05 në wiik kaa 8 (ANOVA de kuɛɛr kaa rou). Tɛ̈n cï gɔ̈t: Acïn kë cï tääu thïn të thööŋë yen ke CTRL. (B) Ciɛɛm: Kë ye nyuɔɔth de biäk de nhom cï gɔ̈t ke nɔŋ kën ye MTCO1 gël (thëm de nhom, 20 μm). Të tɔ̈u ë guɔ̈p de Purkinje thïn acï thiɔ̈ɔ̈ŋ në pïu ë pïu. Ciɛɛm: Thëm de MTCO1 (tök de thëm de kä wääc; n = 7 agut cï 20 cells cï thëm tënë cuɔl kaadiäk). (C) qPCR thëm de namba de mtDNA cï gɔ̈t në PN cï tɛ̈ɛ̈kic (thëm de kueer töŋ de kä wääc; n = 3 agut cï 7 cuɔl). (D) Ciɛɛm: Kë ye nyuɔɔth de nhom cï gɔ̈t ke nɔŋ kën ye DNA gël (thëm de nhom, 20 μm). Të tɔ̈u ë guɔ̈p de Purkinje thïn acï thiɔ̈ɔ̈ŋ në pïu ë pïu. Ciëën: Thëm de mtDNA cï riääk (kueer töŋ de cɛɛth de kä wääc; n = 5 agut cï 9 de kä cï röt looi tënë cuɔl kaadiäk). (E) Kë ye nyuɔɔth de biäk de nhom dït ye mitoYFP + Purkinje nyuɔɔth (kë cï thɔ̈ɔ̈r) në tɔ̈ɔ̈u de nhom ëbɛ̈n yic. (F) Käk ë IV ë thëm. (G) Kä cï röt looi në thɛɛr ke tɔ̈c yiic në CTRL ku Mfn2cKO yiic. Tɛ̈ tɔ̈u nhial: Pulse tueŋ cï AP cak. Të tɔ̈u piiny: AP ë thäät juëc. (H) Ciin de kä ye röt looi në thɛɛr ke tɔ̈c yiic (sPSPs). Kë ye tɔ̈u në nyin de kä cï keek dɔm yiic ku thööŋ de kä cï keek juak thïn aye keek nyuɔɔth në (I). Töŋ de kä wääc cï keek tïŋ acï keek tïŋ n = 5 agut cï 20 cells tënë cuɔl kaa diäk. Kä cï yök aye keek lueel ke ye thööŋ±SEM; *p<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Kä ye tɔ̈u në nyin de AP cï rot looi yetök cï keek gɔ̈t në luɔɔi de dhöl de gël de kë cï yök. Të tɔ̈u nhial: AP ë thäät juëc. Tɛ̈n tɔ̈ piiny: zoom de AP tök. (K) Tääu ë thëm de AP ë thëm ë thëm ë thëm ë (J). Thëm de Männ-Wïtnëy; n = 5 ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät. Kä cï yök aye keek lueel ke ye thööŋ±SEM; acie kë thiekic.
Kë nyic de OXPHOS cï riääk acï yök në Mfn2cKO PN cï naŋ wiik kaa 8, ye nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke luɔɔi de nhom de nhom ee kë rac apɛi. Ku na yïn ya, ke ɣok acï käjuëc ke karaba ye tɔ̈ në OXPHOS yic ya caath në wiik kaa 4 agut cï wiik kaa 7 ku wiik kaa 7 agut cï wiik kaa 8 në luɔɔi de tɔ̈ɔ̈u de kä ye röt looi në thɛɛr ke cerebellar yiic (Thiɛ̈ŋ 2E). Cï të këc yen thɔ̈ɔ̈ŋ thïn, ke thööŋ de lɔ̈ŋ de nhom ku thööŋ de kä ye tääu thïn ke Mfn2cKO neurons aake thöŋ kenë gël de nhom, agut cï na cɔk ya naŋ wuɔ̈ɔ̈c thiin koor në kaam de cells yiic (Table 1). Cït mɛn de, në wiik kaa 4 agut cï wiik kaa 5 ke run, acïn kë dït cï rot waar në thööŋ de thɛɛr-ke tɔ̈c (IV curve) cï yök (Thiɛ̈ŋ 2F). Ku na yïn ya, ke ka cïn Mfn2cKO neurons nɔŋ wiik kaa 7 agut cï wiik kaa 8 cï pïïr në IV regimen yic (në thɛɛr ke tɔ̈c yiic), man ye nyuɔɔth ke nɔŋ kë ŋic raan ëbɛ̈n në thɛɛr ke thök yiic. Në thööŋ, në Mfn2cKO neurons, ke pïu ye pïu cɔk dhuk röt (AP) aye kek yök apath, ku ye nyuɔɔth ke pïuken kedhiɛ acie wuɔ̈ɔ̈c apɛi kenë pïu ye kek mac në wiik kaa 8 yiic (Table 1 ku Thura 2G). Cït mɛn de, thök ku thök de thök de thök de thök (sPSCs) aake ye thɔ̈ɔ̈ŋ ke thök de akutnhom de gël, ku thök de kä cï röt looi acï rot juak në wiik kaa 4 agut cï wiik kaa 5 agut cï wiik kaa 7 agut cï wiik kaa 8 ke nɔŋ kë thöŋ ke dït (Thiɛ̈ŋ 2, H ku I). Thɛɛr ke dït de nhom në PNs (25). Kä thöŋ ke kä cï bɛ̈n bei aacï keek yök ke PNs cï keek tääu në pïu yiic cï keek tääu në pïu yiic. Ajuɛɛr kënë ee kä lëu bïk röt looi ke ATP de cellular gël, cïmën lëu bï rot ya looi në tɔ̈ɔ̈u de käŋ yiic kedhiɛ. Në ye mɛn, ke tɔ̈c de nhom ku jɔl ya tɔ̈c de Mfn2cKO acïï kek ye riɔ̈ɔ̈k (Thöŋ 2, J ku K). Në wël lik yiic, ke kä cï kek yök ëtënë aye nyuɔɔth ke PNs nɔŋ OXPHOS cie luui apath alëu bïk ya rëër apath në dhɔ̈l juëc yiic, ku ye nyuɔɔth ke nɔŋ ajuiɛɛr benë kek ya gël agokë ya rëër në dhɔ̈l thiääk kenë kä ye kek yök yiic.
Kä cï yök aye keek lueel ke ye kën thööŋë ± SEM (thëm töŋ de thööŋ de kä wääc, thëm de thööŋ de kä juëc ke Holm-Sidak; *P<0.05). Namba de unit aye nyuɔɔth në thëm de thëm.
Acuk tääu bïk käŋ ya thiëëc mɛn nɔŋ akuɔ̈tnhïïm tɔ̈ në akut de kä cï kek yök yiic (Thöŋ 1G) nɔŋic dhɔ̈l lëu bïk OXPHOS dït apɛi ya gël, ku kän ee kë yenë PN cï riääk lëu bï ya tɔ̈ ke thiääk kenë thɛɛr ke tɔ̈c (Thöŋ 2, E agut cï K) ya guiir. . Cɛɛth cï looi në käm yiic acï yen bɛ̈n nyuɔɔth ke kä ye tɔ̈ në mïïth yiic ye tɔ̈ në mïïth yiic (BCAA) aye kek lac mac apath (Thoŋ de 3A ku Thura de S5A), ku kë cï bɛ̈nbei në akër yic ee cɔl acetyl-CoA (CoA) ka ye cɔl succinyl CoA. Acuk yök ke tɔ̈ në BCAA yic 1 (BCAT1) ku BCAT2 kedhiɛ aacï röt juak. Aye dhöl tueeŋ de BCAA cɔk lɔ tueŋ në luɔɔi yenë kek cak në α-ketolutarate yic (26). Kä thi kɔ̈k peei ye tɔ̈ në biäk de keto acid de hydrogenase (BCKD) yic aye kek mac apath (käjuëc käkë aye kek cɔk lɔ tueŋ ku cïï röt ye bɛɛr dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n në BCAA yic) (Thoŋ de 3A ku Thura de S5A). Ku na yïn ya, ke ka cïn kë ye rot waar në BCAA yic cï yök në PN cï tɛ̈ɛ̈kic yic, man lëu bï ya tɔ̈ në kë cenë kä thiekiic ke amino acids käkë ya juak në luɔɔiden yic (glucose ka lactic acid) agokë TCA ya juak në thɛɛr juëc yiic (Thiɛ̈ŋ S5B). PNs cïn OXPHOS aye nyuɔɔth ëya dɛ̈t lɔn cï glutamine thök ku thök ë thök ë thök ë thök ë wiik kaa 8, ku kën alëu bï rot nyuɔɔth në thök ë thök ë thök ë thök ë thök (GLS) ku thök ë thök ë thök ë thök (Thoŋ 3, A ku C). Alëu bï ya ŋic ke lööŋ ke GLS aye tɔ̈ në thɛɛr ke tɔ̈c yiic (GLS-GAC) (wɛ̈ɛ̈r de Mfn2cKO/CTRL ee thöŋ ke 4.5-thök, P = 0.05), ku lööŋ keen ye kek tääu nhial në räl ke tuanytuɛɛny yiic. (27).
(A) Kë ye nyuɔɔth në atuɔ̈c yic ee rot waar në thëm de mïïth yiic në dhöl cï lueel yic në wiik kaa 8 yiic. (B) Cïmën de thëm de nhom cï gɔ̈t ke nɔŋ kën ye PCx gël (thëm de nhom, 20 μm). Athör ye ɣer ee guɔ̈p de Purkinje nyuɔɔth. (C) Thɛɛr ke thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök ë thök (t-thëm juëc, *FDR <5%; n = 3-5 cuɔl). (D) Nhial: Thura cï looi ee dhɔ̈l wääc yiic ke lɔ në carbon cï gɔ̈t yic tɔ̈ në [1-13C] kën yenë käŋ yök thïn (cït mɛn de, në PDH wala dhöl yenë käŋ cath në pïu yiic). Tënë piny: Athör ë violin acï thëm de pïu ë tök (M1) nyuɔɔth cï waar bï ya pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu, pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë [1-13C]pyruvate (thëm de t-tök; ** P <0.01). (E) Cɛɛth de akököl de thaa ëbɛ̈n de dhöl cï nyuɔɔth. Tïŋë mïïth ke P<0.05 në wiik kaa 8 yiic. Kë cï gɔ̈lpiny: acïn kë cï juiir (cɛɛth de kä wääc në kuɛɛr kaa rou; * P <0.05; *** P <0.001). Kä cï yök aye keek lueel ke ye kën thööŋë±SEM.
Në cɛɛthda yic, ke BCAA acï bɛ̈n ya töŋ de dhɔ̈l yenëke käŋ mac apath. Yen yic kënë ee ril yic apɛi nyuɔɔth lɔn yenë pïu ë pïu ë pïu yiic lɔ në TCA yic lëu bïk röt waar në PN cïn OXPHOS. Kän alëu bï ya tɔ̈ ke ye kë dïït yenë nhom bɛɛr ya waar, man lëu bï ya naŋ kë ye rot looi në nhom yic ku jɔl ya pïïr de raan yic në thɛɛr yenë OXPHOS rac apɛi. Cïmën de wɛ̈t cï lueel kënë yic, ɣok acï yök ke kën tueeŋ ye rim cɔk thök ë rim PCx ee tɔ̈ nhial-tök (Mfn2cKO/CTRL ee rot waar në thɛɛr kaa 1.5; Thura 3A), man ye rïŋ cɔk ril bï ya rim cɔk thök (28), man ye gam ke ye tɔ̈ në nhom yic. 30). Cïmën de kä cï kek yök në kä cï kek yök yiic, ke kä thi kor ye kek tïŋ në käŋ yiic acï kek ya nyuɔɔth ke PCx ee rot juak në PNs cïn OXPHOS yiic, ku PCx ee rot lac juak në kä thiääk kenë yen ke Bergmann glial cells ke gël yiic (Thoŋ 3B). Ku bï PCx ya them në luɔɔiden yic, ke ɣok acï nhom bɛ̈n ya tääu në [1-13C] kë yenë nhom yök. Na cï pyruvate ya tääu në pïu yiic në pïu yiic (PDH), ke kë ye cɔl isotope ee jäl, ku ka ye mat në TCA yic të cenë pyruvate ya waar në pïu yiic (Thoŋ de 3D). Në kuɔɔny ë wëlkuɔ ke proteomics, ɣok acï ciin dïït de kä ye nyuɔɔth tïŋ tënë kën ye käŋ tïŋ në kä cï keek tɛk yiic ke Mfn2cKO, ku kä cï keek tɛkpiny ke Mfn2cKO, ku kä cï keek yök ke citric ku kä ye keek tïŋ ëya dɛ̈t anɔŋ kë tɔ̈u ciɛɛl, naa cak tɔ̈u ke cïï thiekic (Thiɛ̈ŋ 3D).
Në nhom de MitoPark yic ke cuɔl nɔŋ tuanytuɛɛny ke nhom ye bɛ̈n në nhom de nhom yiic ye nhom de raan ëbɛ̈n riɔ̈ɔ̈k në nhom de raan yic (Tfam) (Thöŋ de S6B), ke PCx ee rot lac looi ëyadɛ̈ (31), ku kän ee yen nyuɔɔth ke nhom de raan ëbɛ̈n ee tuanytuɛɛny ke nhom ya cɔk riääk. OXPHOS ë gup. Alëu bï ya ŋic ke cï yök ke enzymes wääc (32-34) lëu bïk röt ya nyuɔɔth në nhom yiic lëu bïk ya thiääk kenë tuanytuɛɛny ke rim aye kek tääu nhial në PNs cïn yic OXPHOS, cïmën de mɛ̈c ë nhom (PCC-A), ku jɔl ya mɛ̈c ë nhom. (ME3), ë luɔide ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät ë thäät (Thöŋ 3, A ku C) (33, 35). Në ye mɛn, ɣok acï yök ke dït apɛi në Pdk3 yic, man ye PDH cɔk tɔ̈ ke cïï lui (36), ku ka cïn kë cï rot waar cï yök në Pdp1 yic ye PDH cɔk lui wala PDH ë rot (Thiɛ̈ŋ 3A). Në thɛɛr juëc yiic, në Mern2cKO PNs yiic, ke tɔ̈c de α1 (PDHE1α) de tɔ̈c de pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë Ser293 (cï ŋic ke ye luɔɔi de PDH gël) acï juak ( Thura S6C) (Thöŋ S6C). Pyruvate acïn dhöl yenë rim lɔ thïn.
Në thök, ɣok acï yök ke dhöl dït apɛi yenë rïŋ ku glycine cak, ku dhöl thiääk kenë 1C ku rïŋ ë pïr (Thoŋ 1G ku Thura S5C) aye röt tääu nhial kedhiɛ, cïmën cenë ye lueel në wël cï kek lueel yiic, në thɛɛr yenë kek luɔɔi thïn. Kä tɔ̈ në ye lɔ̈ɔ̈m aye luui në thɛɛr ke tɔ̈c (5-7). Cɛɛth cï looi në wël ke proteomics yiic acï yen bɛ̈n nyuɔɔth ke PN kenë OXPHOS cï määr, ke nhom de cuɔl nɔŋ wiik kaa 8 acï kek ya tääu në 2 (SHMT2), man ye ya kë tueeŋ yenë nhom cɔk lɔ tueŋ apath. Kë thiekic ë gël ë guɔ̈p (Thiɛ̈ŋ S5D). Në 13 ke CU-glucose-cï tääu në nhom yic, ke thëm de kä ye röt looi në mïïth yiic acï lööŋ ke serine ku proline ya cɔk tɔ̈ nhial, ku ye nyuɔɔth ke cäth de carbon në serine ku proline yic ee rot juak (Thoŋ de S5E). Në kë yenë kä ye röt looi në GLS ku GPT2 kek ya mukthuul në tɛ̈ɛ̈k de mïïth yiic ku jɔl ya tɛ̈ɛ̈k de mïïth yiic në kaam de mïïth yiic ku α-ketoglutarate, ke lööŋken aye nyuɔɔth ke OXPHOS-deficient neurons aye naŋ kë wïc kek në mïïth yiic. Në thööŋ de kee kä cï röt waar käkë yiic, ke thëm de kä cï röt waar ke cerebellor astrocytes tënë PN-tök Mfn2cKO mice acï nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke kee dhɔ̈l käkë (cït mɛn de kä ye röt waar kedhie) acïï röt ye waar apɛi në luɔɔiden yic, ku kën acï nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke gɛɛr de kä ye röt waar ee PN cï riääk (Fig. S6).
Në wël lik yiic, ke kä cï kek ya caath käkë acï käjuëc wääc yiic ke thɛɛr ke metabolic ya nyuɔɔth në PNs yiic. Na cɔk ya tɔ̈ ke cïï thöŋ kenë luɔɔi de nhom, ke ka lëu bï ya cɔk tɔ̈ ke cï riääk në thɛɛr lik yiic ku bï 1C ya bɛɛr looi (Thöŋ de 3E ku Thura de S5C), ku jɔl ya käjuëc ye röt waar në tɛ̈n yenë I ku IV röt luɔɔi thïn, ke käjuëc ye röt waar në luɔɔi de serine de novo yic aye röt lac looi në thɛɛr cï tëëk yiic. OXPHOS ë thäät ë luɔi (Thöŋ 3E ku Thöŋ S5C). Kä cï kek yök ëtënë aye ajuiɛɛr yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ yiic guiir agonë ​​mïïth ya cɔk loi röt apath (1C cycle) ku jɔl ya cytoplasmic (ciɛɛl de kä ye kek yök në thɛɛr kɔ̈k yiic) ku bïk röt ya juak në thɛɛr ke TCA yiic agokë mïïth ya cɔk loi röt apath.
PNs cïn OXPHOS nɔŋ wiik kaa 8 alëu bïk luɔɔi de miɛt de piɔ̈u ya muk ku bïk ya tɔ̈ në thɛɛr juëc yiic agokë luɔɔi de mitochondrial ya cɔ̈kpiny. Kë cï yök kënë acï kë puɔth apɛi cɔk bɔ̈ nhial lɔnadɛ̈ ke yee thaar kën, kee käke wal käkë aalë bïkë käke wal yök ëya dɛ̈t bïk gääu wala bïk tuaany de nhom gël. Ba gau. Wɔ cï ye kën lëu rot looi në käŋ kaa rou ke kɔc lääu nhïïm. Në kueer tueeŋ yic, ɣok acï kën ye cɔl Cre-gël në tuaany de nhom (AAV) looi ago MFN2 ya kuanycök në PNs cïn OXPHOS në vivo yic (Thiɛ̈ŋ S7A). AAV ee MFN2 ku jɔl ya mCherry (Mfn2-AAV) ye wël lueel në mCherry yic (Mfn2-AAV) acï kek ya yök në ciɛɛŋ de nhom tueeŋ yic në vitro yic, man cï MFN2 bɛ̈n ya nyuɔɔth në dhöl yenë Cre gɛɛi në yen ku ye nhom cɔk tɔ̈ ke cïn kë ye rot waar në nhom yic, ku kän ee nhom ya gël në MfnKO, B Thura S2c7). Në thɛɛr kɔ̈k yiic, ɣok acï käke thëm de vivo looi bïk Mfn2-AAV nɔŋ wiik kaa 8 bɛ̈i tënë nhom de Mfn2cKO ku gëlku col, ku thëmku col nɔŋ wiik kaa 12 (Thiɛ̈ŋ 4A). Mfn2cKO cï tɔ̈ɔ̈u acï thou (Thöŋ 1, A ku B) (16). Viral ee rot waar në vivo yic ku ye PN cɔk loi rot në ɣän kɔ̈k ke nhom yiic (Thoŋ de S7, G ku H). Tɛ̈u ë AAV ye mCherry (Ctrl-AAV) nyuɔɔth yetök acïn kë thiekic ye looi në thök de nhom tënë läi ke Mfn2cKO. Në thööŋ, thööŋ de Mfn2cKOs cï thɔ̈ɔ̈ŋ ke Mfn2-AAV acï nyuɔɔth lɔn nɔŋ yen kë thiekic ë gël de PN ë thäät (Thiɛ̈ŋ 4, B ku C). Në ye mɛn, ke thëm de neuron ee rot looi ke cïï lëu bï ya tek thook kenë läi ye kek mac (Thiɛ̈ŋ de 4, B ku C, ku jɔl ya Thura de S7, H ku I). Tɛ̈n yenë MFN1 rot nyuɔɔth thïn ku ka cie MFN2 ee luui apath në thon de nhom yic (Thöŋ 4C ku Thura S7, C ku F), man ye nyuɔɔth ke tɛ̈n yenë MFN1 rot nyuɔɔth thïn alëu bï ya tɔ̈ ke cïn MFN2. Cɛɛth dɛ̈t peei cï looi në PN tökic acï nyuɔɔth ke Mfn2-AAV ee tɔ̈ ke ye raan ë tɔ̈ në thɛɛr juëc yiic, ku ye mtDNA cɔk tɔ̈ ke thöŋ, ku ye thɛɛr juëc ke PCx ye tɔ̈ në thɛɛr ke tɔ̈c yiic dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n (Thoŋ 4, C agut cï E ). Cɛɛth de kä ye tïŋ ke mɛ̈c ke Mfn2cKO cï keek kony në thɛɛr ke lɔ̈ŋ yiic acï nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke tɔ̈cden ku kä ye keek nyuɔɔth ke rïnythii (cäth S1 agut cï S3) acï röt juak. Në thökde yic, ke kä cï kek them käkë aye nyuɔɔth ke gääu yenë MFN2 bɛɛr tääu në PNs yiic ku ka cie lac yök në OXPHOS yic ku ka lëu bïk mtDNA ya dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n ku bïk tuanytuɛɛny ya cɔk loi röt, ku bïk axon ya gël ku bïk ya thou në vivo yic.
(A) Aguiɛɛr ye nyuɔɔth lɔn yenë thëm de thëm de AAV tääu në MFN2 yic të cenë dhöl de metabolic cï nyuɔɔth ya luui. (B) Thuraa ke nhom cï thök në wiik kaa 12 cï keek waar yiic në wiik kaa 8 në cuɔl ke Mfn2cKO ku cï keek gɔ̈t në kä ye nhom gël. Ciɛɛm: Thëm de käke axon. Thëm de dït de axon ee 450 ku 75 μm. (C) Ciɛɛm: Thëm de thëm de käke Purkinje në thëm de AAV (AAV+) (tök de thëm de kä wääc; n = 3 cuɔl). Ciɛɛm: mtDNA acï tïŋ në PN cï waar yic në wik kaa 12 (t-thëm cïn kë cï mat; n = 6 käke cuɔl kaa diäk). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Kä ye tɔ̈ në nyin de kä ye röt waar yiic ke PNs ke Mfn2cKO ke nhom cï kek tääu në kä cï kek nyuɔɔth yiic ke tuanytuɛɛny. Kë yenë kɔc nhïïm kum ee të cï dendrites dɔm thïn nyuɔɔth, ku kë ye maketh cï gɔ̈t ee të yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ thïn nyuɔɔth në baŋ ciɛɛm; n ee tɔ̈ në nyin de nhom. Thëm kë, 1μm. (E) ee nyooth de PCx tɔ̈u në PN cï waar yic në wiik kaa 12 nyuɔɔth. Thëm kë, 20μm. OE, thööŋ de kä juëc; FC, gɛ̈r ë gɛ̈r.
Në thök, ɣok acï piath de pïïr de kä ye yök në PNs yiic cï OXPHOS yök ke cï riääk yök. Wɔ cï mCherry looi ye AAV-shRNA (RNA thiin nɔŋ nhiɛ̈m cekic) looi ye cɔl PCx mRNA de col (AAV-shPCx) yenë col dɔm, ku tuɔɔc bairäth ka kä ye kek mac apath (AAV-scr) në nhom de col de Mfn2cKO yic. Aciëŋ ë tɔ̈ɔ̈u acï looi në wik kaa ŋuan ë run (Thöŋ 5A) bï PCx kɔ̈ɔ̈c ë luɔi yök në thɛɛr ë PCx ë tɔ̈u ë tɔ̈u (Thöŋ 3C) ku PN cell layer aŋot ke tɔ̈u (Thöŋ 1A). Alëu bï ya ŋic lɔn nadë ke PCx cï thɔ̈ɔ̈r piny (Thiɛ̈ŋ S8A) ee PN dït apɛi cɔk thou, man ye thök në ring cï tuany (Thiɛ̈ŋ 5, B ku C). Në kë bïnë tɛ̈n yenë käŋ röt waar thïn ya deetic në tɛ̈n yenë PCx tääu nhial në lööŋ yiic, ke ɣok acï tɛ̈n de redox de PNs ya puɔ̈ɔ̈c në thɛɛr cenë PCx ya tääu piny ku AAV-cï ya tɔ̈ në thɛɛr juëc yiic ke Grx1-roGFP2 acï kek ya lueel në thaa tökic (Thiɛ̈ŋ de S8, B agut cï D) agonë ​​mïïth ya thɔ̈ɔ̈ŋ në thɛɛr juëc yiic. Ku, ɣok acï käŋ kaa rou ke pïïr de raan ëbɛ̈n looi (FLIM) në nhom dït apɛi de Mfn2cKO nɔŋ wiik kaa 7 wala gël de kä lëu bïk röt waar yök në tän de redox de cytoplasmic të cïnë käke FLIM yök (Thöŋ S8, E agut cï G). Cɛɛth cï looi acï nyuɔɔth ke tɔ̈ ke cï rot juak në thɛɛr ke tɔ̈c yiic në Mfn2cKO PNs tökic cïn PCx ye nyuɔɔth, man ye wuɔ̈ɔ̈c kenë tɔ̈ɔ̈u de nhom ka Mfn2cKO PNs ye shRNA cï thɔ̈ɔ̈r yetök nyuɔɔth (Thiɛ̈ŋ 5, D ku E). Na cï PCx ya tääu piny, ke ciin de Mfn2cKO PNs ye tɔ̈ ke cï rot juak në thɛɛr juëc yiic kaadiäk (Thiɛ̈ŋ 5E), ku ye nyuɔɔth ke PCx ee rot juak në thɛɛr juëc yiic (Thöŋ de 5E), ku ye nyuɔɔth ke PCx ee tɔ̈ ke cï rot juak në thɛɛr juëc yiic.
(A) Aguiɛɛr ye nyuɔɔth lɔn yenë thëm de thëm de thëm de AAV shPCx tääu në thëm yic të cïnë dhöl de metabolic cï nyuɔɔth ya luui. (B) Thuraa ke confocal ye tɔ̈u në wiik kaa 8 yiic në cuɔl ke Mfn2cKO cï keek waar yiic ku cï keek gɔ̈t në kä ye nhom gël në wiik kaa 4 yiic. Thëm kë, 450μm. (C) Thëm de thëm de käke Purkinje në AAV-cï waar yic (tök de thëm de kä wääc; n = 3 agut cï 4 cuɔl). Kä cï yök aye keek lueel ke ye thööŋ±SEM; ***P<0.001. (D) Thura de FLIM ye tɔ̈ në nyin de kɔc yiic ee pïïr de PN nɔŋ wiik kaa 7 nyuɔɔth ye glutathione redox Grx1-roGFP2 nyuɔɔth në kä cï kek lueel ke thëm yiic. LUT (thööŋ-tïŋ-nhial) thööŋ: thɛɛr ke pïïr (në thɛɛr ke pïïr). Thëm kë, 25μm. (E) Kë cï gɔ̈t acï tɛ̈ɛ̈k de pïïr de Grx1-roGFP2 nyuɔɔth tënë (D) (n=158 agut cï 368 ë thäät yiic në thäät kaa rou yiic në thäät yiic). Kë cï gɔ̈t në thëm de thëm tɔ̈ nhial në thëm de thëm tökic: ee namba de thëm de thëm de thëm de pïïr dït (thith, thëm) wala thëm thiin (kë ɣer, thëm) nyuɔɔth, ye 1 SD waan në thëm de pïïr tɔ̈ ciɛɛl në CTRL-AAV-scr. (F) Kë cï lueel ee gël de PCx de neuronal nyuɔɔth.
Në këriɛ̈ɛ̈c yic ëbën, wël cï kek yök ëtënë aye nyuɔɔth ke dhukciɛ̈ɛ̈n de MFN2 alëu bï PN cï lɔ tueŋ ya kony abɛ̈n ke nɔŋ OXPHOS dït apɛi, mtDNA dït apɛi, ku jɔl ya tɔ̈c cït man de ista, ku yenëka ye ŋoot ke lɔ tueŋ agut cï tuanytuɛɛny dït apɛi. Tɛ̈ yenë nhom riääk thïn ee kä ye röt dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n ya nyuɔɔth ke cell këc thou. Tɛ̈n yenë mïïth röt lac waar thïn ee rot lac looi në luɔɔi de neurons bïk tuanytuɛɛny ke rim ya cɔk loi röt (cïmën de TCA), man ye PCx gël në PNs cïn yic OXPHOS ku ye thon de cell cɔk loi rot, ku ye luɔɔi de gël de guöp looi (Thöŋ de 5F).
Në ye puɔ̈ɔ̈c kënë yic, ɣok acï kä ye nyuɔɔth bɛ̈n lueel ke dhuŋnhom de PNs tënë OXPHOS ee rot lac dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n në TCA yic në dhöl wääc yenë käŋ looi në ajuɛɛr de metabolic yic. Acuk thëm de proteomic yök ke nɔŋ dhɔ̈l juëc kɔ̈k peei ye kek kony ku luelku ke të cenë kek ya thɔ̈ɔ̈r në tuanytuɛɛny riliic ke mitochondrial, ke neurons aye naŋ dhɔ̈l juëc ëke këc kek ya ŋic wënthɛɛr yenëke mïïth cɔk ril yiic. Kë cï ɣok gäi, ee ajuɛɛr de rewiring ëbɛ̈n acie tɔ̈ ke ye kë ye cɔl metabolic de nhom ye lac thök amääth ku cïï rot ye bɛɛr dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n, ku wëlkuɔ aye lueel ke lëu bï neuron ya muk agut cï thɛɛr ke cell këc thou. Kë cï yök kënë ee yen nyuɔɔth ke neurons aye naŋ käjuëc ye röt looi në guöp yic. Kë ye yic kënë ee yen nyuɔɔth ke tɛ̈n cenë MFN2 bɛ̈n bɛɛr looi në thɛɛr kɔ̈k bï bɛ̈n tueŋ yiic, alëu bï kä thiekiic ke metabolic ya dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n ku bï PN ya gël ago cië ye bɛɛr riääk. Në thöŋ de yic, ee tɔ̈ɔ̈u de rim gël ku ye rim cɔk thök. kɔc cï röt waar.
Töŋ de kä cï kek yök në rïthäcda yic ee kë cenë PNs cïn yic OXPHOS lëu bïk TCA ya cɔ̈kpiny në dhöl yenë enzymes ya cɔk tɔ̈ nhial ago rim ya cɔk ril yiic. Ajuɛɛr de mïïth ee kë ye lac yök në räl ke cancer yiic, kɔ̈k ke kek aye röt gɛɛi në glutamine yic agokë TCA ya juak ago kä thöŋ kenë kek ya cɔk tɔ̈ piiny, man ye rïŋ cɔk tɔ̈ piiny ku ye rïŋ cɔk loi rot (39 , 40). Athör cï piac gɔ̈t acï nyuɔɔth lɔn nadë ke tɔ̈ në räl kɔ̈k yiic ye OXPHOS yök ke cïn kë ye looi, ke tɔ̈c de glutamin/glutamine ee kë ŋic ëyadɛ̈ (5, 41), të yenë dhöl yenë glutamine lɔ thïn në TCA yic tɔ̈ në rin ë tɔ̈c de OXPHOS (41). ). Ku na yïn ya, ke ka cïn kë ye nyuɔɔth apath në kë de thöŋ de kä ye röt looi në guöp yic ku jɔl ya tɛ̈n lëu benë kek ya thiääk kenë tuanytuɛɛny. Në puɔ̈ɔ̈c cï piac looi në vitro yic, ke mɛ̈c ke nhom tueeŋ acï kek ya nyuɔɔth ëke ye glutamate pools cɔk lɔ tueŋ agonë ​​mɛ̈c ya cɔk lɔ tueŋ apath, ku kän ee mɛ̈c cɔk lɔ tueŋ apath ku bïk mɛ̈c ya cɔk lɔ tueŋ apath (42). Alëu bï ya ŋic ke tɔ̈ në thɛɛr ke gël de wal yiic ke TCA yenëke pïu cɔk lɔ tueŋ apath, ke pyruvate carboxylation aye gam ke ye tɔ̈ ke ye tɔ̈ɔ̈u de oxaloacetate në thɛɛr ke tɔ̈c yiic (34). Ku na yïn ya, ke thiääk de kee dhɔ̈l käkë kenë räl ke nhom (të yenë tuanytuɛɛny ke nhom gam ke ye tɔ̈ në astrocytes yiic) aŋot ke nɔŋ kë thiekic ye yök në nhom yic (43). Në ye kën yic, wëlkuɔ aye nyuɔɔth lɔn ye PNs cï riääk në OXPHOS në guɔ̈p yic lëu bïk röt waar në BCAA ë thök ku pyruvate ë thök, ku kek aye käŋ kaa rou ë thök ë TCA pool tɔ̈ ciɛɛl. Na cɔk ya tɔ̈ ke ye kë ye BCAA cɔk loi rot në riɛl de nhom yic, ke luɔɔi de glutamate ku jɔl ya GABA në luɔɔi de nhom yic (44), ke ka ŋoot ke cïn kë ye nyuɔɔth në kee dhɔ̈l käkë yiic në vivo yic. Ku na yïn ya, ke ka piɔlic apɛi bï ya lueel ke PNs cïï lui apath alëu bïk röt ya dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n në thök de TCA yic në tɛ̈n yenë kek thɔ̈ɔ̈ŋ thïn në kë yenë kek juak në atherosclerosis yic. Në ye wɛ̈t kënë yic, ke lööŋ ke PCx alëu bï kek ya wïc agonë ​​aspartic acid ya cɔk lɔ tueŋ apath, man ye lueel ke ye luɔɔi de cells ye lac luui apath (45). Ku na yïn ya, ke tɛ̈n cenë käŋ ya caath thïn akëc käjuëc cï röt geer ya nyuɔɔth në tɛ̈n yenë aspartic acid tɔ̈ thïn në Mfn2cKO PNs yic (Thuɔ̈ɔ̈r de S6A), man ye thɔ̈ɔ̈ŋ ke ye luɔɔi wääc de aspartic acid nyuɔɔth në kaam de kä ye röt juak yiic ku jɔl ya kä ye röt lac looi në thɛɛr kɔ̈k yiic. Na cɔk ya tɔ̈ ke dhöl yenë PCx mac në nhom cie luui apath yic në vivo yic ŋoot ke këc ŋic, ke ɣok acï ya nyuɔɔth ke dhuŋnhom de nhom kän ee luɔɔi thiekic looi në gël de redox de nhom yic, man cï ya nyuɔɔth në thëm de FLIM yic në cerebellar slices yiic. Në ye wɛ̈t kënë yic, ke gël de PNs ago cië ye bɛɛr mac në PCx yic alëu bï käjuëc ya cɔk loi röt ku bï cell ya lac thou. Luɔɔi de BCAA ye rot riɔ̈ɔ̈k ku jɔl ya tɛ̈n yenë pyruvate rot luɔɔi thïn acie dhɔ̈l yenëke räl ke guöp ya ŋic (7). Ku na yïn ya, ke ka ye tïŋ ke ye kë tueeŋ yenë OXPHOS yök në nhom, agut cï na cɔk ya kë töŋ yenë nhom yök, man ye kë thiekic apɛi tënë nhom. .
Tuɛnytuɛny ke nhom aye ya tuanytuɛɛny wääc yiic ye röt lac nyuɔɔth ke ye ataxia ku ye PNs lac riɔ̈ɔ̈k (46). Ciin de neuron käkë aye lac yök ke cïn kë yekë looi në kë yenë kek lac riääk në cuɔl yiic ku bïk käjuëc ke tuanytuɛɛny ke nhom ya cak (16, 47, 48). Cï të cenë ye luɛɛl thïn në wël cï kek lueel yiic, ke col cï looi në col yic kenë gene cï rot waar ee thiääk kenë tuanytuɛɛny ke nhom ku ka nɔŋ tuanytuɛɛny ke nhom (49, 50), ku ye jam në piath de puɔ̈ɔ̈c de kä dhal kɔc në ciɛ̈n OXPHOS në PNPH yic. Ku na yïn ya, ke ka piath bï ya tek thook ku bï ya puɔ̈ɔ̈c në ciin de neuron wääc yiic. Ku na yïn ya, ke PNs aye lac yök në aliiric yic ku ka ye ciin de cerebellar cells kedhiɛ cɔk tɔ̈ piiny, në puɔ̈ɔ̈c juäc cï kek ya looi yiic, ke tɛ̈n benë kek ya tek yiic ke ye cells kedhiɛ aŋot ke ye kë rilic apɛi. Na cɔk ya kë cïï rot ye lëu bï ya yök ke cïn kë rɛɛc ye rot looi në cell kɔ̈k yiic (cïmën de räl ke kɔcdït), ke ɣok acï dhöl path yenë käŋ tɛ̈ɛ̈k yiic mat kenë FACS agoku ciin dïït de neurons ya yök agonë ​​käjuëc ke protein ya deet yiic, ku ka nɔŋ käjuëc ke protein cï kek ya yök (cïmën de 3000 de cerebel). (51). Na ye pïïr de raan ëbɛ̈n gël, ke dhöl ye ɣok käŋ bɛ̈i thïn ëtënë ee ɣok puɔ̈l buk kä ye röt waar në dhöl yenë käŋ röt waar yiic ya tïŋ abac, ku jɔl ya tɛ̈n yenë käŋ röt waar thïn ëyadɛ̈, man ye luɔɔi de kä ye röt waar në pïïr de raan yic cɔk dït apɛi. (52, 53). Kueer ye ɣok ye lueel acie thiääk kenë kuɛ̈n de käke Purkinje yetök, ku ka lëu bï ya luɔ̈ɔ̈i në dhöl dɛ̈t peei yic ago käjuëc ye röt waar në nhom de kɔc tuany yiic ya cɔ̈kpiny, agut cï dhɔ̈l kɔ̈k peei yenëke nhom de raan tuany cɔk thök.
Në thök, ɣok acï yök ke ye kën yenë kɔc töök yök në thɛɛr ke tɛ̈ɛ̈k de käŋ yiic lëu bï kä thiekiic ke tɔ̈c de cellular ya dhuɔ̈kciɛ̈ɛ̈n ku bï tɔ̈c de nhom ya gël. Ku na yïn ya, ke tɛ̈n yenë luɔɔi de rewiring ya deet yic cï ya kiɛ̈ɛ̈t ëtënë, alëu bï kɔc ya nyuɔ̈th dhɔ̈l lëu benëke ya töök në thɛɛr cenëke mitochondrial ya luui apath. Rïthäc bï ya looi në akälciɛ̈ɛ̈n ee wïc bï kä ye röt waar në thɛɛr kɔ̈k ke nhom yiic ya tek yiic agonë ​​luɔɔi de ye löŋ kënë ya nyuɔɔth në tuanytuɛɛny kɔ̈k peei ke nhom yiic.
MitoPark ë thäät acï keek lueel wënthɛɛr (31). C57BL/6N ë thɔ̈ɔ̈r ë loxP ë thɔ̈ɔ̈r ë Mfn2 ë thɔ̈ɔ̈r acï keek lueel wënthɛɛr (18) ku thɔ̈ɔ̈r kek thɔ̈ɔ̈r ë L7-Cre (23). Kä cï bɛ̈nbei thïn aake cï kek ya tɛk në cuɔl yiic agonë ​​mïïth ke Purkinje ya cak agonë ​​Mfn2 ya cak. Në biäk thiin de tɔ̈c yic, ke Gt (ROSA26) acï bɛ̈n ya yök në dhɔ̈l kɔ̈k peei yiic (20). Käke läi kedhiɛ aake cï kek ya looi cï tɛ̈n cenë kek ya luɛɛl thïn në lööŋ ke Europe, baai ku jɔl ya akuɔ̈tnhïïm kɔ̈k peei yiic ku ka cï kek ya gam në kɔc ke pinynhom ëbɛ̈n. Luɔɔi de läi ee lööŋ ke Akutnhom de Kɔc ke Luɔɔi de Läi ke European kuanycök ëyadɛ̈.
Na cï tɔ̈ɔ̈u de nhom de tiŋ cï liac tääu në ye guɔ̈p, ke mɛ̈th ke mouse aye keek nyaai (E13). Kë cï yök në pïu yiic acï tɛ̈ɛ̈kic në pïu cï thɔ̈ɔ̈ŋ ke pïu yiic (HBSS) cï juak thïn në 10 mM Hepes ku tɛ̈ɛ̈u në pïu yiic cï keek waar yiic nɔŋic pïu cï thɔ̈ɔ̈ŋ (20 U/ml) ku pïu cï thɔ̈ɔ̈ŋ (1μg/ml). Tääu ë rɛ̈l në DMEM yic) ku tɛ̈ɛ̈k ë yic në dhöl yenë rɛ̈l cɔk thök. Ml) në 37°C në minit kaa 20, ku ka cï bɛ̈n ya tääu në DMEM yic ku ka cï ya juak në 10% de pïu ke mɛ̈th cï dhiëëth yiic. Kä cï kek tääu në glass kɔ̈u cï kek kum në polylysine në thiɛk de 2×106 në 6 cm de adin de ciɛɛŋ yic ka në thiɛk de 0.5×105 kä cï kek cak/cm2 agonë ​​thura ya deet yiic. Në thɛɛr kaa 4 yiic, ke kën ë pïu ë pïu yiic acï waar në pïu ë pïu ë pïu yiic ë 1% B27 ë pïu yiic ku 0.5 mM GlutaMax. Käke nhom aake ye keek muk në 37°C ku 5% CO2 në thëm yic abɛ̈n, ku ye keek cam naa tök në wik. Në kë bïnë käŋ bɛɛr määt yiic në kä ye kek tïŋ yiic, ke 3μl (aduŋ nɔŋ pïu kaa 24) ka 0.5μl (aduŋ nɔŋ kä kaa 24) de käm cï kek tääu në AAV9 yic aacï kek bɛ̈n ya looi agonë ​​nhom ya töök në kööl de rou yic në kä ye kek tïŋ yiic. AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Kë cï mat thïn, namba de 105530-AAV9) ku AAV9.
DNA de col cɔl Mfn1 ku Mfn2 (ye yök tënë Addgene plasmid #23212 ku #23213, në tök) aye kek gɔ̈t në tɛ̈ɛ̈k de V5 (GKPIPNPLLGLDST) në thök de C, ku ka ye kek mat kenë mCherry në tɛ̈ɛ̈k de T2A yic. Grx1-roGFP2 ee kë cï gäm ë Ɣëëdelbärg TP Dïck DFKZ (Aciëŋ ë Käk ë Käŋ ë Käŋ). Në waar de kë cï thuur në tdTomato yic në luɔɔi de dhɔ̈l thɛɛr ke luɔɔi, ke kë cï thuur acï bɛ̈n tääu në kɔ̈u de pAAV-CAG-FLEX-tdTomato yic (namba de 28306) agonë ​​pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNFA2-V5 ya cak. Flëx-mChërrï-T2A-MFN1-V5 ku PAAV-CAG-Flëx-Grx-röGFP2 bëktör. Aguiɛɛr thöŋ kenë ye wɛ̈t kän acï bɛ̈n ya looi agonë ​​pAAV-CAG-FLEX-mCherry ya mac. Në kë bïnë AAV-shPCx looi, ke plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) aye wïc, nɔŋic DNA cï tɛ̈ɛ̈kic ye shRNA ye col PCx wïc. 3′) Në gël de U6 ë gël, mCherry ee luui në gël de CMV ë gël. Luɔɔi de kä ye AAV kuɔɔny acï looi cït mɛn cïnë raan ë loi yeen ye lueel (Cell Biolabs). Në wël lik yiic, ke luɔɔi de gɛ̈ɛ̈r de plasmid ye mCherry-T2A-MFN2-V5 muk (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) në thɛɛr lik yiic ke Gɛɛr de 2MFAV2 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ka Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ee kä ye kek cɔk ŋic kek, ku jɔl ya mïïth ye kek yök në AAV1 yic ku jɔl ya mïïth kɔ̈k peei ye kek määt yiic. Kë cï bɛ̈n bei në bairäth yic acï bɛ̈n yök në pïu cï liɛɛr yiic në pïu cï riɛl yiic/ethanol ku cï kek tääu në pïu yiic (PBS). Kë ye cɔl AAV acï bɛ̈n ya cɔ̈kpiny në kë yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ në thɛɛr kaa 24 yiic në 32,000 rpm ku jɔl ya 4°C) ku ka cï kek ya tääu në käŋ yiic në kë yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ në Amicon. Kë ye cɔl AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 thööŋ de käke guɔ̈p (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX acï them në thaar thɛɛr). (qPCR) -mfn1-v5 (1.9×1013 gc/ml) änd AAV1-cag-flëx-grx-rögphp2 (8.9×1012 gc/ml).
Kä tueŋ ke nhom aake cï keek nyaai në pïu lir yiic 1x PBS, cï keek tääu në pïu yiic, ku ka cï keek tääu në 0.5% de Triton X-100 / 0.5% de pïu yiic/PBS ë pïu yiic nɔŋic pïu ë pïu yiic ku pïu ë pïu yiic (Roche). Thëm de kä ye cam aye looi në luɔɔi de thëm de kä ye cɔl bicinchoninic acid (Kë nyic käŋ de Thermo Fisher). Kä ye cam acï kek ya tek thook në SDS-polyacrylamide gel yenë kek tääu në pïu yiic, ku ka cï kek ya tääu në pïu yiic (GE Healthcare). Tääu ë ɣän cïï thöŋ ku tääu ë keek në kä tueŋ ke gël (tïŋ Table S1 në wël juëc yiic) në 5% de ca në TBST yic (Tris-cï tääu në pïu yiic kenë Tween), kuɛɛr ke lɔɔk ku kä ke rou ke gël në TBST Tɔ̈ɔ̈u. Tääu ë pïu yiic në akɔ̈l yic në +4°C. Na cï thök ë pïu, ke yïn tääu ë pïu ë thäät kaa 2 ë pïu ë ɣöt. Në thɛɛr kɔ̈k yiic, ke tɛ̈ɛ̈u ë kë töŋ kënë yic kenë kä ye β-actin gël, ke kë töŋ cï tääu thïn acï yök. Yök në gɛ̈ɛ̈r de kä ye pïu cɔk bɔ̈ bei ku gɛ̈r de kä ye pïu cɔk bɔ̈ bei (GE Healthcare).
Kä cï kek kɔn com në glass yiic aake cï kek ya tääu në 4% de pïu yiic (PFA)/PBS në thaar cï lueel yic në atuɔ̈c de ɣöt yic në minit ka 10 yiic. Kä cï keek kum aye keek kan tääu në 0.1% de Triton X-100/PBS yic në minit ka 5 në atuɔ̈c de ɣöt yic, ku ka ye keek tääu në kë ye keek gël yiic [3% de pïu ke thɔ̈k (BSA)/PBS]. Në kööl de rou, ke kä cï keek kum aacï keek lɔ waak në kë ye käŋ gël ku tɛ̈ɛ̈uë keek në kë thöŋ ke fluorophore-conjugated kën ë gël ë käŋ në thɛɛr kaa 2 në thɛɛr ke atuɔ̈c de ɣöt; thök, kä cï them aacï keek lɔɔkic apɛi në PBS yic ke 4′,6-dïamidino-2 -Phenylindole (DAPI) acï keek thɔ̈ɔ̈ŋ ku ka cï keek tääu në thëm de kä thiik yiic ke Aqua-Poly/Mount.
Mice (moc ku diäär) aake cï keek tääu në pïu yiic në tɔ̈ɔ̈u de pïu yiic (130 mg/kg) ku pïu ë pïu yiic (10 mg/kg) ku tɛ̈ɛ̈uë keek në pïu yiic ke pïu ë pïu yiic (5 mg/kg) , Ku tɛ̈ɛ̈uë keek në kë yenë pïu ë pïu yiic tääu në pïu yiic. Tääu ë nhom piny ku luɔ̈ɔ̈i ë thëm de lec bï bak de nhom ë nhom thöŋ ke yuɔɔm de mis (tënë lambda: yɔ̈l 1.8, thök 1, thöŋ ke thök IV ku V). Luɔ̈ɔ̈i ë thɛ̈m de syringe cï gɔ̈ɔ̈r yic ba ɣön thiin ë nhom looi apath ago pïu tɔ̈ piiny cïï riɔ̈ɔ̈k. Ku ëcï tääu në pïu yiic amääth në pïu yiic (jɔɔk në -1.3 agut cï -1 në baŋ ciɛɛl de dura mater), ku 200 agut cï 300 nl AAV aye tääu në pïu yiic në pïu yiic (Narishige) kenë pïu ye tääu në kɔc cin (Narishige) në thɛɛr juëc yiic agut cï -1. minit ë ɣöt. Na cï thök ë pïu, ke yïn tääu ë pïu ë pïu yiic në minit ka thiäär yiic ago pïu ë pïu yiic ya tɛkpiny ëbɛ̈n. Na cï capillaries nyaai, ke dɛ̈l aye tääu në dhöl yic apath ago tɔ̈ɔ̈k ë tɔ̈ɔ̈k ya cɔk tɔ̈ piiny ku bï läi ya cɔk pïïr. Läi aake ye kek töök në wal ke tuanytuɛɛny (caspofen) në nïn juëc yiic të cenë kek ya töök, në ye thaa kënë yic ke gupken aake ye kek tïŋ apath ku ka cï kek ya nɔ̈k në thaa cï lueel yic. Käk ë luɔi abɛ̈n aake cï ke looi cït mɛn tɔ̈u yen në lööŋ ke Europe, baai ku akutnhïïm ke lööŋ ku kaa cï keek gam në kɔc ke pinynhom ku kɔc ke pinynhom ëbɛ̈n, Germany.
Läi aacï keek tääu në pïu yiic në pïu yiic (100 mg/kg) ku pïu ë pïu yiic (10 mg/kg), ku piɔ̈u acï tääu në 0.1 M PBS tueŋ, ku jɔl ya 4% PFA në PBS yic. Aciëŋ acï tɛ̈ɛ̈kic ku tɛ̈ɛ̈u ë 4% PFA/PBS ë thää ë 4°C. Kë ye thɔ̈ɔ̈r (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) acï luɔ̈ɔ̈i bïnë biäk de thɔ̈ɔ̈r (50 μm thiek) looi tënë nhom cï tääu në PBS yic. Ke këc lueel, ke tɔ̈ɔ̈u de kä ye cath në pïu yiic acï looi cït mɛn cïnë ye lueel nhial (13) në atuɔ̈c de ɣöt ku thɛ̈m de käŋ. Në wël lik yiic, tueŋ, ë thëm cï yök acï tääu në 0.5% Triton X-100/PBS yic në minit ka 15 në thëm de ɣöt; në thɛɛr kɔ̈k yiic (Pcx ku Shmt2), në thɛɛr ke EDTA yiic në 80°C (PH 9) ke tɔ̈ɔ̈u de kä cï keek tɛkpiny në minit kaa 25 ke cie kën. Në ye cök ciëën kënë yic, ke biäk käkë aacï kek ya tääu në kä tueeŋ yiic (tïŋ Table S1) në kë yenë käŋ gël yiic (3% BSA/PBS) në 4°C në akɔ̈l tökic ke cï kek ya tääu në pïu yiic. Në kööl dɛ̈t, ke biäk cï kek tɛ̈ɛ̈k yiic aacï kek ya lɔɔk në pïu yiic ku ka cï kek ya tääu në pïu yiic në thɛɛr kaa 2 yiic në thɛɛr ke tɔ̈c yiic; në thök, ke biäk aacï keek lɔɔkic apɛi në PBS yic, ku thɔ̈ɔ̈ŋë keek në DAPI, ku jal keek tääu në AquaPolymount Në kë yenë käŋ tïŋ në kä thiik yiic.
Kë yenë käŋ tïŋ në mac yic (TCS SP8-X wala TCS Athöör de Nuur, Kä thiik ke Leica) cï looi keke nuur ɣeer ku 405 nuur ɣeer yenë käŋ tïŋ acï luɔ̈ɔ̈i bïnë kë cï them thuur. Në këde miɛt de piɔ̈u de kë ye cɔl fluorophore ku mɛ̈ɛ̈të yic de kä ye nyuɔɔth keke kën ye käŋ yök (HyDs), kën loi LAS-X acï luɔ̈ɔ̈i bï athuɔ̈ɔ̈r cï määtiic määtiic cït mɛn de kä ye nyuɔɔth ke Nyquist në kueer cï mac kɔ̈ɔ̈th: tënë kä cïï thöŋ, ee kë ye nyuɔɔth ril arëët (cït mɛn, në käke guɔ̈p ku kä ye cɔl Hybrid) mt Mödë BrïtR). Gating jɔɔk në 0.3 agut cï 6 ns aye luɔ̈ɔ̈i bï kë tɔ̈u ciëën cuɔtpiny.
Thura de thaar yic de kä cï keek tɛkpiny. Na cï tɛ̈ɛ̈k yic në Neurobasal-A yic nɔŋic 1% de B27 ye juak thïn ku 0.5 mM GlutaMax, ke kä cï kek lac tääu në kä cï kek tääu në pïu yiic (μ-Kë cï tääu në pïu yiic (μ-Kë cï tääu në Glass8 yic, Ibidi, namba de catalog 80826)) , ku ka cï kek ya tɔ̈ɔ̈u në 1% de CO2. ku bïk rëër. Thura de thaar yic acï looi në kën ye käŋ tïŋ në Leica SP8 cï looi keke kën ɣeer ye käŋ tïŋ, HyD, 63×[1.4 kën yenë käŋ tïŋ (NA)] kën yenë käŋ tïŋ në miök ku kën yenë mac tääu thïn.
Col acï lac tääu në pïu yiic ku tɛ̈ɛ̈u ë nhom piny, nhom acï lac nyaai në nhom, ku tɛ̈ɛ̈m në 200μm dït (në thëm de 13C ë gɛ̈tgɛ̈t) wala 275μm dït (në thëm de photon kaa rou) abak de sagittal cï thiäŋ në käke crece VH-6. Kɔc ŋic käŋ, Walldorf, Germany) acï thiäŋ në kä cït käkë: 125 mM pïu cï liɛɛr, cï thiäŋ në aliir (95% O2 ku 5% CO2) tɔ̈ piiny Ca2 + pïu cï looi në nhom (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM buffer m3, 1.25 mM sodium phos. glükösë, 0.5 mm Cacl2 änd 3,5 mM MgCl2 (ösmötïc prëssïön 310 tën 330 mmol). Tuɔɔcë kä cïke yök ke nhom tën ɣän ke tɔ̈ɔ̈u nɔŋiic Ca2 + ACSF juëc apɛi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM kë ye pïu cɔk tɔ̈u thïn, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 25.0 mM d-glucose. MgCl2) Mëdïum) pH 7.4 yän 310 tën 320 mmöl).
Në thɛɛr ke luɔi de thura, kä cï keek tɛkpiny aacï keek lɛɛr të cï juiir de thura, ku kën them acï looi në ACSF lɔtueŋ tɔ̈u në atuɔ̈c cïï rot ye waar de 32° agut cï 33°C. Kë yenë kä thi kor tïŋ në kä thiik ke kä ye ɣɛɛr (TCS SP8 MP-OPO, Kä thiik ke Leica) cï looi keke kën ye käŋ tïŋ ke Leica 25x (NA 0.95, pïu), Ti: Kä ye tïŋ ke kä thiik ye cɔl Sapphire (Kë ye tïŋ në kä thiik yiic II, Kë cï mat) acï luɔ̈ɔ̈i ke ye kën ye käŋ tïŋ. Mödülë FLIM (PïcöHärp300, PïcöQuänt).
FLIM de Grx1-rögfp2. Kä ye röt geer në tän de PNs yiic aacï kek ya them në FLIM nɔŋ käŋ kaarou në nhom de raan yic, man yenë Grx1-roGFP2 kä ye PNs yök. Në baŋ de PN yic, ke të yenë käŋ yök thïn aye kuany në ciin de 50 agut cï 80 μm tɔ̈ piiny në baŋ ciɛɛl de piny yic ago PN ya lëu bï ya luui (cïmën de, ciɛ̈n kë cï looi në nhom ka käjuëc ye röt waar në nhom yiic) ku jɔl ya käjuëc ke roGFP2 ye käŋ yök ku AAVx mCërï). Kuɔ̈ɔ̈të thuraa ke thëm tök kenë 2x thëm de käke aliiric [bɛ̈r de thëm de thëm: 890 nm; 512 nm 512 pïxël]. Kë cï yök: HyD tɔ̈ thïn, akutnhom de kä ye pïu thɔ̈ɔ̈ŋ (FITC)] ku thura ye thɔ̈ɔ̈ŋ në minit kaa 2 agut cï minit kaa 3 aye keek luɔ̈ɔ̈i bïk nyuɔɔth lɔnadɛ̈ ke pïu juëc apɛi aye keek määt yiic (1000 pïu ë pïu yiic në thööŋ) bïkë pïu thɔ̈ɔ̈ŋ. Kë ye Grx1-roGFP2 yök ku yök de käke FLIM aacï keek looi në biöök de pïïr de roGFP2 naa cï 10 mM H2O2 juak thïn tën ACSF cï tääu thïn (bï pïu cɔk dït apɛi, ye pïïr cɔk juak rot), ku jal yaa juak thïn në pïïr de raan yic). thök, ku thök ë pïïr ë raan ëbɛ̈n) (Thiɛ̈ŋ S8, D agut cï G). Luɔ̈ɔ̈i ë FLIMfit 5.1.1 ë thëm de kä cï bɛ̈n bei thïn, thöŋë kë töŋ de thëm de thëm de thura abɛ̈n tënë thëm de IRF (luɔɔi de dhuŋnhom de kë yenë käŋ looi), ku χ2 ee thɔ̈ɔ̈ŋ ke ye 1. Ba yup de pïïr de PN tök ku thëm de pïïr de raan ëbɛ̈n në nhom, kë yenë käŋ kum aye thɔ̈ɔ̈ŋ në thɛɛr ke pïïr në nerve lɔ̈ɔ̈m. ë luui ë thëm de käŋ.
Cɛɛth de käke guɔ̈p. Na cï biäk de acute tääu në 100 nM TMRM yic cï mat kenë ACSF cï tääu në pïu yiic në minit kaa 30, ke kä ye röt waar ke PNs aacï kek them në kë yenë käŋ tïŋ në käŋ kaarou yiic. TMRM thura acï looi në thëm de thëm de 920 nm ku luɔɔi de HyD tɔ̈ thïn (tɛ̈ɛ̈m de thëm de thëm: 585/40 nm) bï kä ye nyuɔɔth määt yiic; në luɔɔi de thëm de thëm de thëm thöŋ ku luɔɔi de HyD wääc tɔ̈ thïn (FITC :525/50) bï mtYFP thuur. Luɔ̈ɔ̈i ë kë ye yup de thura de ImageJ yenë käŋ yup thïn agonë ​​kä lëu bïk röt ya looi në cell tökic ya them. Në wël lik yiic, ke kë ye yup de plug-in: kë ye nyuɔɔth = min (mtYFP, TMRM) aye luɔ̈ɔ̈i bïnë ɣän ke kä ye nyuɔɔth ke TMRM nyuɔɔth në thoŋ de Purkinje Somali në thura töŋ de kë thöŋ kenë yeen. Ku të yenë pixel tɔ̈ thïn në kë yenë kɔc nhïïm kum yic aye them, ku ka ye kek thɔ̈ɔ̈ŋ në thura töŋ de mtYFP yic agonë ​​biäk de käm ya yök ye kä lëu bïk kek ya looi ya nyuɔɔth.
Thura acï tɛ̈ɛ̈kic keke Huygens Pro (Thuɔ̈ɔ̈r de Käke Kɔc Nyic Käŋ) käke luɔi. Në thuraa ke tiles cï keek thɔ̈ɔ̈ŋ, ke tɔ̈ɔ̈u de tiim tök aye looi në luɔɔi de thëm de thëm ye rot looi yetök cï bɛ̈i në LAS-X software. Të cïnë thura thëm, luɔ̈ɔ̈i ë ThuraJ ku Adobe Photoshop bï thura ŋoot ke loi ku thöŋ ë thëm de thëm ku thëm de thëm. Luɔ̈ɔ̈i Adöbë Ëlïsträtör përäpärätï gräfïk.
mtDNA ë thëm de nhom. Ciin de mtDNA cï riääk acï them në biäk de nhom cï gɔ̈t keke kä ye DNA gël në kë ye daai në kä thi kor. Tɛ̈n ë thëm ëbɛ̈n acï looi tënë guɔ̈p de thëm ku thëm de thëm ëbɛ̈n, ku ɣän ë thëm ëbɛ̈n acï keek yup në luɔɔi de thëm de kä juëc (ImageJ software). Tääu ë ɣän ke nuclear bei tënë ɣän ke guɔ̈p de cell ago ɣän ke cytoplasmic yök. Në thök, kën yenë käŋ tïŋ thïn (Athör de ImageJ) acï luɔ̈ɔ̈i bï käke DNA ke cytoplasmic thɔ̈ɔ̈ŋ yetök ye mtDNA nyuɔɔth në thura de thök, ku kä cï bɛ̈n bei aacï keek thɔ̈ɔ̈ŋ keke PN thööŋ de CTRL cuɔl. Kä cï bɛ̈n bei aaye keek lueel ke ye ciin de kä ye tɔ̈ në cell tökic.
Cɛɛth de luɔɔi de mïïth. Luɔ̈ɔ̈i ë ImageJ de Thura de Thura de Plug-in bï mïïth ke mïïth ya thɔ̈ɔ̈ŋ në PN yic në thɛɛr ke cell tökic. Në wël lik yiic, në thura töŋ de dhöl thöŋ yic, në kë ye yup yic: kë ye nyuɔɔth = min (mtYFP, kën ye guɔ̈p gël), tën kën ye guɔ̈p gël ye guɔ̈p nyuɔɔth tënë kä kɔ̈k ye guɔ̈p gël në Purkina aye yök. Ku të yenë pixel tɔ̈ thïn në kë yenë kɔc nhïïm kum yic aye them, ku ka ye kek tääu në thura töŋ de mtYFP yic agonë ​​biäk de mïïth cï kek ya nyuɔɔth ya yök.
Cɛɛth de thëm de thëm de thëm de Purkinjë. Kë ye cɔl ImageJ acï luɔ̈ɔ̈i bïnë thëm de Purkinje them në tɛ̈ŋ de nambaai ke Purkinje cï keek kueen në bɛ̈ɛ̈r de nhom cï dɔm në kä cï keek kueen.
Käk ë thëm ë juiir ku mɛ̈ɛ̈të yic. Aciëŋ ë akut ë gël ku cuɔl Mfn2cKO aacï keek tääu në 2% PFA/2.5% ë glutaraldehyde në 0.1 M ë pïu ë pïu yiic (PB), ku jal yaa biäk de coronal aacï keek looi në luɔɔi de ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria). tïïträöxïdë änd 1.5% pötässïüm fëröcïänïdë ät tëëmpërätürë rumö för 1 hör. Kä cï keek tɛ̈ɛ̈kic aacï keek lɔɔk në pïu cï liääp yiic në door yiic kaadiäk, ku ka cï keek tääu në 70% de ethanol nɔŋic 1% de uranyl acetate në minit kaa 20. Kä cï ke tek yiic aacï keek nyaai në miääu yic ku tɛ̈ɛ̈uë keek në Durcupan ACM (Araldite cï tääu në pïu yiic) në pïu yiic (Kë yenë käŋ tïŋ në karaba yic, namba de 14040) në kaam de kä cï keek thiɔ̈ɔ̈ŋ në maraya, ku në akër në 60°C bï keek looi në mac yic. Aciëŋ de nhom acï kuany ku biäk thiik apɛi kaa 50 nm acï keek tɛm në Leica Ultracut (Leica Mikrosystem GmbH, Vienna, Austria) ku kuany keek në 2×1 mm de ayöm cï tɛk cï thiɔ̈ɔ̈ŋ në kë ye cɔl polystyrene. Kä cï keek tɛ̈ɛ̈kic aacï keek tääu në pïu yiic ke 4% de uranyl acetate në H2O yic në minit ka 10, ku lɔɔk në H2O në thɛɛ juëc yiic, ku jɔl ya Reynolds lead citrate në H2O yic në minit ka 10, ku jɔl ya lɔɔk në H2O në minit ka 10 yiic. Kä thiik cï thuur aacï keek lööm keke kën ye käŋ tïŋ në këde käke aliiric cɔl Philips CM100 (Thirmo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ke luui TVIPS (Ajuɛɛr de Luɔɔi de Bidiö ku Thura) TemCam-F416 kën thura de käke aliiric (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Jɛrmanï).
Në cuɔl cï AAV dɔm, ke nhom acï tek yic ku tɛ̈ɛ̈m në biäk de 1 mm dït apɛi, ku nhom acï them në kë yenë käŋ tïŋ në pïu yiic agonë ​​AAV yök (yenë kee, mCherry ye nyuɔɔth). Kä ye kek them ëke yenëke AAV tääu në kɔc yiic yenëka ye luɔɔi dïït apɛi në thɛɛr ke Purkinje yiic (cïmën de thɛɛr kedhiɛ) në thɛɛr kaarou yiic ke cerebellar yiic yenëke luui në kek. Kë cï tääu në AAV yic acï bɛ̈n tɛkpiny në akɔ̈l yic (4% PFA ku 2.5% në 0.1 M de kë ye tääu në pïu yiic) ku ka cï bɛ̈n bɛɛr looi. Në kë cenë EPON tääu thïn, ke räl cï kek tääu thïn aacï kek ya lɔ waak në 0.1 M de pïu yiic, ku ka cï kek ya tääu në 2% de OsO4 yic në 0.1 M në thɛɛr kaa 4 yiic, ku ka cï kek ya lɔ waak në thɛɛr kaa 2 yiic. Dhuɔ̈kë 3 thää ke 0.1 M kölämïdë büfër. Në ye thaa kënë yic, ke miök cï kek tääu në miɔ̈k yic aacï kek bɛ̈n ya tääu në 4°C yic në minit ka 15 agonë ​​räl ya nyaai. Kä cï kek tääu në pïu yiic aacï kek ya tääu në pïu yiic ku ka cï kek ya tääu në EPON yic në 4°C. Tääu ë rïŋ ë EPON yam yic ë thää 2 yiic, ku tääu ë 62°C ë thää 72 yiic. Luɔ̈ɔ̈i ë kë ye käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ (Ajuɛɛr de Leica, UC6) ku kë ye cɔl diamond (Aciëŋ, Biel, Switzerland) bï kä thiik apɛi ke 70 nm tɛm, ku tääu ë 1.5% de uranyl acetate në minit kaa 15 në 37°C, ku tääu ë kë ye cɔl lead citrate në minit kaa 4. Kä thiik ke karaba cï keek lööm në luɔɔi de JEM-2100 ku kä thiik ke karaba ke cäth (JEOL) cï keek tääu në kë yenë käŋ thuur 4K 16-bit (Gatan) ku käke thura de käke aliiric (Gatan). Tënë cïïtë yic, kä thiik ke karaba aacï keek yök keke 5000× wala 10,000× thëm de käke aliiric.
Cɛɛth de kä ye röt looi në pïïr de raan yic. Në kä cï kek ya deet yiic kedhiɛ, ke tɛ̈n yenë raan tök yök thïn acï ya guiir në athuɔ̈ɔ̈r ke aliiric yiic në luɔɔi de ImageJ. Kä wääc ke pïïr de raan aye keek caath. Kë dït de nhom aye lueel ke ye ciin de bɔɔtic ye yök të tek ë nhom de nhom ëbɛ̈n në nhom (tën de nhom = nhom de nhom-tën de nhom) × 100. Tɛ̈n de nhom de nhom aye yup në dhöl [4π∙2(tënë)/perimeter. Tän de ista de mitochondria acï ya caath ku tek yic në rou (“kä ye tɔ̈ në pïu yiic” ku “kä ye tɔ̈ në pïu yiic”) cï tɛ̈n tɔ̈ kek thïn.
Namba de ötöpägösöm/lïsösöm ku thëm de thëm de käŋ. Luɔ̈ɔ̈i ë ImageJ ë thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm. Të yenë käŋ cam thïn aye lueel ke ye ciin de bɔɔtic cï yup të tek yic de kä ye röt looi në cell yiic në ɣän ke cell yiic (tën de cell=tën de cell-nucleus)×100. Density de kä ye cam/kä ye cam aye keek yup të tekë nambaai ke ciin de kä ye cam/kä ye cam në cell tökic (në thööŋ de ɣän ke pïu) (tën de pïu = ɣän ke pïu-nuclear).
Bäbëlïng för äkutë sëkcïönïng änd prëpärätïön sämplë. Tën kä ye nyuɔɔth ye wïc bï glucose gɔ̈t, lɛɛrë nhom dït apɛi të tɔ̈u yen thïn, nɔŋic kä cï thiäŋ (95% O2 ku 5% CO2), Ca2 + ACSF juëc (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate. 25.0 mM d-glöcös, 1.0 mM CaCl 2 änd 2.0 mM MgCl 2, cï juiir tënë pH 7.4 ku 310 ɣet 320 mOsm), wën cï glöcös 13 C 6- Glöcös ë gɛ̈r (Eurisotop, namba CLM9-1). Në kë de kä ye kek them ye wïc bï kek ya gɔ̈t në pïu yiic, ke ka ye nhom tuɔɔc në Ca2 + ACSF yic (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM de pïu tɔ̈ në pïu yiic, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 25.0 mM de glucose. MgCl2, thööŋë pH 7.4 ku 310 agut cï 320mOsm), ku juak 1mM 1-[1-13C]pyruvätë (Eurisötop, namba de CLM-1082). Tääu ë thäät yiic në minit ka 90 në 37°C. Në thök de thëm, kä cï ke tek yiic aacï lac lɔk në pïu yiic (pH 7.4) nɔŋic 75 mM pïu yiic, ku jal keek mat në 40:40:20 (v:v:v) pïu yiic (ACN): pïu yiic. Të cïnë kä cï ke tek yiic tääu në pïu yiic në minit kaa 30, kä cï them aacï keek tääu në 21,000 g në minit kaa 10 në 4°C, ku kë cï yök apuɔth acï tääu në kë yenë käŋ tääu thïn cɔl SpeedVac. Kë cï bɛ̈n bei thïn acï tɔ̈ɔ̈u në -80°C agut cï bï käŋ ya caath.
Cɛɛth de kä juëc ye röt looi në pïu yiic në 13 C-cï gɔ̈t në amino acids. Në thëm de pïu cï röt looi në pïu yiic (LC-MS), ke kä cï röt looi në pïu yiic aacï kek bɛɛr tääu në 75μl de pïu ke LC-MS yiic (Honeywell). Të cïnë 21,000 g tääu në minit ka 5 yiic në 4°C, 20 μl de kë cï juiir acï luɔ̈ɔ̈i bïnë amino acid caath, ku kë cï döŋ piny acï lac luɔ̈ɔ̈i bï anion caath (tïŋ piiny). Cɛɛth de amino acïd acï looi ke luui ë lööŋ cï keek lueel wënthɛɛr ke yök de käm (55, 56). Në thɛɛr tueŋ yiic, 10 μl de 100 mM de pïu ë pïu yiic (Sigma-Aldrich) acï mat në 20 μl de pïu ë pïu yiic, ku 10 μl de 2% de pïu ë pïu yiic (Sigma-Aldrich) acï mat thïn në LC thëm de ACN. Kë cï them acï tääu në pïu yiic amääth ku jal tääu në 21,000 g yic në minit ka 5 në 20°C. Tuɔɔc kë cï lɔɔkic tën kë ye käŋ them yetök 2 ml keke glass cït kën cï tääu thïn (200 μl dït). Kä cï them aacï keek caath në luɔɔi de ajuɛɛr LC (Pïu) cï rek keke Q-Exaktive (QE)-HF (Kë dït apɛi ye käŋ cath) kën dït apɛi ye käŋ tïŋ (Kë dït apɛi ye käŋ tïŋ). Në thëm, 2μl de kë cï yök acï tääu në 100×1.0 mm dït-riɛl de silica T3 thëm (Pïu) nɔŋic 1.8μm kä thiik. Tɛ̈n ë pïu ë pïu yiic ee 100μl/min, ku ajuɛɛr de pïu ë pïu yiic ee pïu ë pïu yiic A (10 mM ë pïu yiic ku 0.15% ë pïu yiic) ku pïu yiic B (ACN). Kë cë yök ë thäät yiic ee kë cït kën: 0%B në 0 minit; 0%B. 0 ë 15% B ë 0 ë 0.1 mïnït; 15 të 17% B të 0,1 të 0,5 mïnüt; B ë 17 ë 55% ë 0.5 ë 14 ë mïnït; B ë 55 ë 70% ë 14 ë 14.5 ë mïnït; ë 14.5 ë 70 ë 100% B ë 18 ë mïnït; 100% B në 18 të 19 mïnütë; 100 të 0% B në 19 të 19,1 mïnüt; 0% B në 19.1 të 28 mïnüt (55, 56). QE-HF thëm de thëm de thëm de thëm ee luui në dhöl de thëm de m/z (thëm/thëm de thëm) de 50 agut cï 750. Kë cï luɔ̈ɔ̈i ee 60,000, ku kë cï yök gël (AGC) thëm de thëm cï yök ee 3×106, ku thëm de m/z milli0conds ee 3×106. Kë yenë mac tääu në mac yic (ESI) ee luui në mac ye mac tääu në 3.5 kV, atuɔ̈c de 250°C, aliir ye cath në 60 AU (kä cï röt looi), ku aliir ye cath në 20 AU. 250°C. S lëns acï tääu ë 60 AU.
Cɛɛth de kä ye röt looi-MS de 13C cï gɔ̈t ke ye kä ye röt looi. Kä cï döŋ piny ke pïu cï röt tääu piny (55μl) acï keek caath në luɔɔi de ajuɛɛr de käke pïu cï röt looi (ICS 5000+, Käke Käke Raan) cï keek rek kenë QE-HF käke pïu (Aciëŋ de Käke Raan). Në wël lik yiic, ke 5μl de kä ye kek yök në pïu yiic aacï kek ya tääu në pïu yiic cï kek tääu në HPLC yic (2 mm×250 mm, dït de kä thii kɔ̈k 4μm, Thermo Fisher Scientific) në puɔ̈c-në dhöl de pïu yiic kenë ciin de 1. 4μm, Thërmö Fïshër Sïcïntäïfïc). Aciëŋ de thëm de thëm aye muk në 30°C, ku kën ye käŋ them yetök aye looi në 6°C. Luɔ̈ɔ̈i ë kë ye cɔl potassium hydroxide ye bɛ̈i keke pïu cï keek nyaai bïkë kë ye cɔl potassium hydroxide gradient looi në kën ye pïu cɔk bɔ̈ bei. Tɛ̈k-tɛ̈k de kä ye röt waar në pïu yiic në 380μl/min, ku tɛ̈ɛ̈uë ë thäät yiic: 0 agut cï 3 minit, 10 mM KOH; 3 të 12 mïnütës, 10 të 50 mM KOH; 12 të 19 mïnütës, 50 të 100 mM KOH; 19 të 21 mïnütës , 100 mM KOH; 21 të 21.5 mïnütës, 100 të 10 mM KOH. Kë cï tääu në thëm yic acï bɛɛr thɔ̈ɔ̈ŋ në 10 mM KOH cök në minit kaa 8.5.
Kä cï kek tääu në pïu yiic aye kek mat kenë 150μl/min de isopropanol cï kek juak thïn në thɛɛr cenëke thäm thök ku ka ye kek tääu në kë yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ yiic ye luui në dhöl cie yic riɛl. MS ee kä juëc tɔ̈ thïn tïŋ jɔɔk në m/z 50 agut cï 750 keke kën ye tïŋ 60,000. AGC aye tääu në 1×106, ku thaar dït de ion aye tɔ̈ɔ̈u në 100 ms. Aciëŋ de ESI cï tääu në mac yic acï luui në pïu ë pïu ë 3.5 kV. Kä kɔ̈k ke tɛ̈ɛ̈u de ion ë tɔ̈u thïn aye käk: tɔ̈ɔ̈u de pïu ë 275°C; gäs ë thɛ̈th, 60 AU; AU në 300°C, ku S ë tɛ̈ɛ̈u ë 60 AU.
Cɛɛth de kä cï yök ke 13C cï gɔ̈t ke kä ye röt waar. Luɔ̈ɔ̈i ë kë yenë käŋ yök (kë cï looi 4.2, Kë ye cɔl Thermo Fisher Scientific) tënë cɛɛth de kä cï yök ke thööŋ de kä ye röt looi. Kë yenë käŋ ŋic acï yök në kë yenë käŋ tïŋ ku ka cï kek ya caath në pɛ̈c. Në kë bïnë thëm de kä ye röt looi looi, ke ɣän cï kek yök ke thëm de kä ye röt looi (XIC) ke 13C (Mn) acï kek bɛ̈n nyaai tënë [M + H] +, man yenë n ya namba de carbon de kä cï kek tääu në ye guöp, yenëke kä cï kek tääu thïn ya caath ka [ MH] + yenëke anions ya caath. Aciëŋ de XIC ee tɔ̈ piiny në biäk kaa dhiëc në miliön tökic, ku aciëŋ de RT ee 0.05 minit. Cɛɛth de kä cï kek yök aye looi në yup de ciin de isotope cï yök tënë amatnhom de isotopes kedhiɛ ke kä thöŋ kenë kek. Käk aye keek gäm ke ye ciin de bɔɔtic tënë isotope tök, ku kë cï bɛ̈n bei thïn aye lueel ke ye ciin de bɔɔtic de molar (MPE), cït mɛn cïnë ye lueel wënthɛɛr (42).
Kë cï liɛɛr në nhom acï tääu në pïu lir yiic në 80% de miök (v/v), cï tääu në pïu yiic, ku cï tääu në -20°C në minit kaa 30. Vortex kë cï them ku tääu ë +4°C në minit ka 30. Kë cï them acï tääu tëde 21,000 g në minit kaa 5 në 4°C, ku kë cï bɛ̈n bei thïn acï määtiic ku cï riɛl ke luui kë ye cɔl SpeedVac në 25°C bï käŋ bɛɛr caath. Cït mɛn cïnë ye lueel nhial ëtënë, LC-MS acï looi në amino acids ke kä cï kek tɛk yiic. Luɔi de kë ye yök (kë ye cɔl 4.2, Kë ye cɔl Thermo Fisher), cïïtë yic kä cë yök aci loi ke luïë kä juëc ke kë tɔ̈u ë tök. Tɛ̈n yenë wël ke metabolite tääu thïn acï ya looi në luɔɔi de ajuɛɛr de luɔɔi de Core (57).
Tɛ̈k-tɛ̈k de juiir. Alɔl acë dac tuɔ̈c aliir ye cɔl carbon dioxide ku tɛ̈ɛ̈m nhom, nhom acë dac nyaai në nhom, ku liɛɛr cï thiäŋ në kë ye yiɛ̈ɛ̈k (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) acï luɔ̈ɔ̈i bï tɛ̈ɛ̈m në 300 agut cï 375 μm aliir O9 sa5d. CO2) Löw Ca2 + ACSF (125.0 mM Nacl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Södïum Pösphät Böffër, 25,0 mM Näcö3, 25,0 mM d-Glükösë, 1,0 mM CaCl2 änd 6,0 ​​mM MgCl302. mÖsm). Tääu ë nhom cï yök tën ɣön nɔŋic Ca2 + ACSF juëc apɛi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM pïu ë pïu ë pïu ë pïu, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM Ca5). ku 310 tën 320 mÖsm). Tääu ë thäät ë thäät ë 20 agut cï minit ka 30 ago keek dhuɔ̈k ciëën ke këc thök ë thäät.
gɔ̈ɔ̈r. Kë yenë daai kä thi kor cï looi keke të yenë käŋ dɔm thïn ku kën yenë käŋ tääu në pïu yiic kaa 20x (Scientifica) acï luɔ̈ɔ̈i tën kä ye käŋ dɔm abɛ̈n. Kä cï kek yök ke Purkinje aake cï kek ya ŋic në (i) dït de guöp, (ii) të tɔ̈në nhom thïn, ku jɔl ya (iii) tɛ̈n yenë mtYFP tɔ̈ thïn. Kë ye tääu në pïu yiic nɔŋ kë ye gël në 5 agut cï 11 megohms aye nyaai në kë yenë pïu tääu në pïu yiic (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Käke Nyïc, Hofheim, Germany) ku kä ye pïu tääu në pïu yiic cï röt riu (P-1000). Kä cïke dɔm kedhie aacï keek looi në ELC-03XS npi kë ye käŋ cɔk dït (npi käke aliiric GmbH, Tam, Germany), cï mac në käke aliiric (kë cï looi 6.0, käke aliiric ke Cambridge, Cambridge, UK). Kë cï them acï dɔm në thëm de 12.5 kHz. Kë ye nyuɔɔth aye thɔ̈ɔ̈ŋ ke käŋ kaa rou ke Bessel thɔ̈ɔ̈ŋ ke thɔ̈ɔ̈ŋ de 1.3 ku 10 kHz në tökic. Kë tɔ̈u në pïu yiic ku pïu yiic aye tääu në pïu yiic në pïu yiic në luɔɔi de kë ye pïu cɔk dït. Thɛ̈m abɛ̈n ake loi keek mac kën thura Orca-Flash 4.0 (Aciëŋ, Gerden, Germany), ye mac ë käke luɔi Hokawo (këde 2.8, Aciëŋ, Gerden, Germany).
Cɛɛth de käke cell abɛ̈n ye looi ku cïïtë yic. Thɛɛr ë gɛ̈tpiny, thiöŋë pipet në pïu tɔ̈ thïn nɔŋic käkë: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATTPG (Na) ku 10.0 mM ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë 7.25, ku pïu ë pïu ë pïu ë 290 mOsm (pïu ë pïu ë pïu). Në thaa wën cïnë riɛl de 0 pA tääu thïn bï pïu ë pïu yiic rac, ke pïu ë pïu yiic cï lɔ̈ŋ acï them. Kë cë tääu thïn aye them në luɔi de -40, -30, -20, ku -10 pA. Thëm ë thëm de thëm de thëm de thëm de thëm ku luɔ̈ɔ̈i löŋ de Ohm bï thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm de thëm. Kä cï röt looi keepɛ̈i aacï keek gɔ̈t në kë yenë mac dɔm në minit ka 5, ku sPSC acï yök ku them në Igor Pro (kë cï looi në 32 7.01, Kä cï röt looi keepɛ̈i, Wɛ̈ɛ̈rdït, Oregon, USA) në luɔɔi de kë cï gɔ̈t ye rot looi yetök. IV ë thëm ku thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm ë thëm wääc (jɔɔk në -110 mV) ku juak ë thëm ë thëm ë 5 mV. Luɔɔi de AP acï them në luɔɔi de kë ye pïu cɔk thök. Cälpë thëllë ä -70 mV ke äplësï dëpölärïsïng pülsës dëcörënt. Ajuɛɛr ë thëm de thëm de thëm de thëm de thëm ë thëm (10 agut cï 60 pA). Yup AP dït apɛi në kuɛ̈n de pulse spikes ye AP dït apɛi bɛ̈i. AP thëm aye caath në luɔɔi de kë de rou de pulse de depolarization ye APs tök wala kä juëc tueŋ cɔk loi rot.
Përfërätëd pätch cönfïgürätïön änd änälïsïs. Loi kë cï dɔm de kë cï looi në luɔɔi de lööŋ cï keek tääu. Luɔ̈ɔ̈i ë pïu ë ATP- ku GTP-cïn ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë 128 mM, 10 mM KCl, 10 mM Hepës, 0.1 mM EGTA ku 2 mM MgCl2, ku tääu ë pH 7.2 (luɔɔi KOH). ATP ku jɔl ya GTP aye kek nyaai në kä ye kek tääu në räl yiic agokë cië ye bɛɛr lɔ në räl yiic. Pipet ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu. Amphotericin acï liääp në dimethyl sulfoxide yic (ciin de akër: 0.1 agut cï 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Kë cï yök në DMSO yic acïn kë thiekic ye looi tënë neurons cï kueen. Në thɛɛr ke punch, ke thëm de dhöl (Ra) acï ya ŋoot ke ye tïŋ, ku thëm acï jɔɔk ke thëm de Ra ku AP cï thök (minit kaa 20-40). Käk ë luɔi ë rot aye them në thëm de pïu ku/wɛ̈lɛ̈/ka thëm de pïu ëmɛn në minit ka 2 agut cï minit ka 5. Cɛɛth kä cï yök acï looi ke luï Igor Pro (cït ë 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (cït ë 2010, Akutnhom de Microsoft, Redmond, USA) ku GraphPad Prism (cït ë 8.1.2, Grapppad Software Inc., La Jolla, CA). Paan de Amerïka). Në kë bï APs ë röt yök, ke IgorPro ë NeuroMatic v3.0c ë tɔ̈u thïn acï luɔ̈ɔ̈i. APs ŋic ë rot ke luui ë thëm cï gäm, ye thɔ̈ɔ̈ŋ ë tök tënë thëm ë thëm. Në luɔɔi de kaam de thëm, yök thëm de thëm kenë thëm dït de thëm de thëm ku thëm de thëm ciɛɛl.
PN ë tɛ̈ɛ̈k. Në thööŋ de kä cï kek gɔ̈t wënthɛɛr, ke PNs acï kek ya cɔk lɔ tueŋ apath në nhom de col yic në thɛɛr cï kek tääu yiic (58). Në wël lik yiic, ke nhom acï tɛ̈ɛ̈kic ku tɛ̈ɛ̈u në pïu yiic [ke cïn HBSS Ca2+ ku Mg2+, cï juak thïn në 20 mM de glucose, pïu ë nhom (50 U/ml) ku pïu ë nhom (0.05 mg/ml)], ku ka cï pïu ë nhom ë pïu ë pïu yiic tääu në pïu yiic [ke cïn HBSS Ca2+ ku Mg2+). / ml), päpäïn (16 U / ml) änd dëöxïrïbönûcläsë I (DNäsë I; 0.1 mg/ml)] Tërät 30 mïnütës ät 30°C. Lɔk ë rɛ̈l tueŋ në HBSS yic nɔŋic pïu ë toŋ (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ku DNase (0.1 mg/ml) në atuɔ̈c de ɣöt yic bï pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu. (0,05 mg/ml) ku DNäsë (0,1 mg/ml) ë lëbï thäl tök. Kë cï bɛ̈n bei thïn acï tɔ̈ɔ̈u në 70μm de tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u yic, ku tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u në tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u (1110 rpm, minit ka 5, 4°C) ku tɛ̈ɛ̈uë tɔ̈ɔ̈u në tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u yic [HBSS, cï juak thïn në 20 mM glucose, 20% tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u de tɔ̈ɔ̈u) Serum, (0.05 mg/ml)]; thëm ë pïïr de räl ke rïŋ ë rïŋ ë rïŋ ku thëm ë rïŋ ë rïŋ ë 1×106 agut cï 2×106 ë räl/ml. Ke thëm de pïu ŋoot ke këc rot guɔ jɔɔk, ke kë cï tääu në pïu yiic acï bɛ̈n ya tɔ̈ɔ̈u në 50 μm de cell yiic.
Flöw cïtömëtër. Tɛ̈k-tɛ̈k de käke guɔ̈p acï looi tën 4°C ke luui adit ke FACSAria III (BD käke pïïr) ku adit ke FACSDiva (BD käke pïïr, kën 8.0.1). Kë cï tääu në pïu yiic acï tɛ̈ɛ̈kic në luɔɔi de 100 μm de pïu tɔ̈ në pïu yiic në 20 psi në thëm de ~2800 kä cï röt looi/sec. Në kë yenë kä thɛɛr yenëke ɣööt thiɔ̈ɔ̈ŋ (ciin de cell, tɛ̈n yenë kek tek thook thïn, ku jɔl ya tɛ̈n yenë kek tɛkpiny thïn) acïï lëu bïk PN ya tek thook tënë cell kɔ̈k peei, ke ajuiɛɛr yenë käŋ mac ee rot gɛɛi në thööŋ yenë YFP thɔ̈ɔ̈ŋ kenë riɛl de mitoYFP+ ​​ku jɔl ya tɛ̈n yenë mitoYFP mac thïn. YFP ee puɔ̈u miɛt në tɛ̈ɛ̈u ë kë cï them yic në 488 nm de thäm de laser, ku kë ye nyuɔɔth aye yök në luɔɔi de 530/30 nm de kë ye käŋ gël. Në cuɔl yiic, ke riɛl thiääk kenë Rosa26-mitoYFP ee ya luui ëyadɛ̈ agonë ​​guöp de raan ya tek thook ku jɔl ya biäk de axon. 7-AAD ee thɔ̈ɔ̈ŋ ke 561 nm ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë 675/20 nm ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu ë pïu cï thou. Acän bï käke piny tek thook në thaar töŋë, kën cï tääu piny acï tääu në ACSA-2-APC, ku kë cï them acï tääu në thäm de laser 640 nm, ku kën ye käŋ dhiim 660/20 nm acï luɔ̈ɔ̈i bï kë ye nyuɔɔth yök.
Kä cï kek määt yiic aacï kek ya tääu në pïu yiic (1110 rpm, minit ka 5, 4°C) ku ka cï kek ya tɔ̈ɔ̈u në -80°C agut cï bï kek ya luɔ̈ɔ̈i. Cuɔl ke Mfn2cKO ku jɔl ya mïthken ke cuɔl aye kek tek yiic në kööl tökic agonë ​​wuɔ̈ɔ̈c de ajuiɛɛr ya cɔk tɔ̈ piiny. FACS wël ë thööŋ ku thööŋ ë wël acï looi në luɔɔi de FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Cïmën cenë ye lueel nhial ëtënë (59), ke PCR në thaŋ yic aye looi agonë ​​DNA ya tek thook tënë neurons cï kek tɛ̈ɛ̈k yiic agonë ​​mtDNA ya them. Kë yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ ku kë yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ acï kek kɔn them në qPCR në nambaai wääc yiic ke cells. Në wël lik yiic, ke 300 PN määt yiic në kë yenë käŋ liääp yiic nɔŋic 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ku mïïth ke mïïth K (200 ng/ml) ku tɔ̈ɔ̈u në 55°C në minit kaa 120. Kä cï kek tääu në 95°C yic në minit ka 10 agonë ​​mïïth ya cɔk thök në luɔi. Në luɔɔi de TaqMan probe (Thermo Fisher) yenë mt-Nd1 them, mtDNA acï them në PCR yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ në 7900HT në ajuɛɛr de 7900HT yic. Nyïny käŋ, nambaa ke Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Nïny de Käke Rec, namba ke AIVI3E8) ku 18S (Nïny de Käke Rec, namba ke Käŋ ke Käŋ Hs99999901_s1) genes.
Prötëöm sämplë prëprätïäsï. Në tuɔ̈c de kë cï yök në 95°C në minit kaa 10 ku thɛ̈m de röl, në kë yenë käŋ liääp [6 M pïu cï liääp, 10 mM pïu cï liääp, 10 mM pïu cï liääp ku 100 mM pïu cï liääp në pïu yiic]. Ön Bïöruptör (Dïägnödë) för 10 mïnütës (30 sëcöndës pülsë / 30 sëcöndës päusë përïöd). Kë cï them acï liääp 1:10 në 20 mM tris-HCl (pH 8.0), cï liääp keke 300 ng dääp (Promega), ku tɛ̈ɛ̈u ë wakɔ̈u në 37°C bï thök ë thök yök. Në kööl de rou, ke kë cï them acï tääu në 20,000 g yic në minit ka 20. Kë cï bɛ̈n bei thïn acï liääp kenë 0.1% de acid cï looi, ku kë cï bɛ̈n bei thïn acï bɛ̈n nyaai në kë cï looi yetök. Kë cï them acï tääu në kë yenë käŋ looi yic (kë yenë käŋ tääu thïn ku 5305) në 45°C, ku kë cï tääu thïn acï tääu në 0.1% de kë ye cɔl formic acid yic. Kä cï keek them kedhiɛ aake cï keek guiir në thaa tökic në raan tök. Acän ba kä cï them ke kä ye cɔla astrocyte tïŋ, 4 μg kä cï keek nyaai acï keek gɔ̈t keke kën dït apɛi (TMT10plex, nambaa 90110, Käke kɔc nyic käŋ) keke kën ye cɔla TMT kën 1:20. Në thööŋ de TMT, 0.8 mg de kë ye yök në TMT yic acï bɛɛr tääu në 70 μl de ACN cïn pïu yic, ku kë cï riɛl acï bɛɛr looi në 9 μl de 0.1 M TEAB (kë ye yök në pïu yiic), wën cïnë 7 μl de kë ye yök në ACN yic mat thïn. Kë cï yök thïn acï 43.75%. Në minit kaa 60 ke tɔ̈ɔ̈u, ke tɔ̈ɔ̈u acï thök në 2 μl de 5% de pïu. Kä cï kek gɔ̈t acï kek bɛ̈n määt yiic, ku tɛ̈ɛ̈uë kek në 200μl de 0.1% de pïu yiic (FA), ku tek kek yiic në rou, ku ka cï kek bɛ̈n nyaai në pïu yiic në luɔɔi de StageTips cï kek looi keepɛ̈i. Luɔɔi de UltiMate 3000 dït apɛi ë pïu ë thëm (Acïn Pïu, Catalog180). Thërmö Pïsër Sëcïnïfïc). Tɛ̈k ë peptides në thëm de 30μl/min, tɛ̈ɛ̈k ë 1% agut cï 50% ë pïu ë B në minit ka 85 ke thëm ë thëm ë 96, ë 50% agut cï 95% ë pïu B në minit ka 3, ku jɔl ya minit ka 8 në 95 % ë pïu B; Kë ye gël A ee 5% ACN ku 10 mM ë pïu ë pïu (ABC), ku kë ye pïu gël B ee 80% ACN ku 10 mM ABC. Kuɛ̈ny ë thäät yiic në minit ka 3 yiic ku mat keek në akuut kaa rou (1 + 17, 2 + 18, ku kɔ̈k) ku tääu keek në pïu yiic në pïu yiic.
Lc-ms/ms änälïsïs. Në këde thëm de kä juëc, kä cï röt looi (namba r119.aq) aacï keek tek thook në 25 cm, 75 μm në ciɛɛl de yic de PicoFrit (kë yenë käŋ tïŋ yam, namba de bak de PF7508250) cï tääu në 1.9 μm Ma. ËASY-nLC 1200 (Thërmö Fïshër Scïntäïfïc, Jërmänë). Kë cï thäm acï tɔ̈ɔ̈u në 50°C. Kä ye A ku B gël aye 0.1% de pïu yiic ku 0.1% de pïu yiic në 80% de ACN yic, në tök. Peptides aacï keek tek yiic tënë 6% agut cï 31% ë pïu ë B në minit ka 65 ku tënë 31% agut cï 50% ë pïu ë B në minit ka 5 ke thëm ë 200 nl/min. Kä cï kek nyaai acï kek ya caath në kë yenë käŋ tïŋ në käŋ yiic (Kë ye cɔl Thermo Fisher). Thëm de m/z de m/z de m/z ee looi në thëm de 120,000 në thëm de 350 agut cï 1500 m/z. Të luui ë 27% de riɛl de thɔ̈ɔ̈r cï thɔ̈ɔ̈ŋ, kën ril apɛi nɔŋ tän de charge de 2 agut cï 6 aye kuany tënë riɛl dït de C ye thɔ̈ɔ̈r (HCD) ye tɛ̈ɛ̈k yic. Thɛɛr ë thëm ë 1 s. m/z ë thëm de thëm de peptide acï them në thëm de ion yic ke luui AGC thiin ë thëm de 5×104 ku thëm dït de thëm de 86 ms. Të cïnë ye tɛkpiny, ke kë tueeŋ acï tääu në lööŋ ke kä cï kek nyaai yiic në 45 s. Kä cï keek gɔ̈t ke TMT aacï keek tek thook në 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap mɔ̈m (Kë dït de kɔc nyic käŋ, namba de 164942), ku cäth de kä ye röt looi aacï keek caath në kë yenë käŋ tïŋ në kë yenë käŋ tïŋ (Kë yenë käŋ tïŋ në käŋ yiic). (FAIMS) käke luɔi (Kë ye cɔl Thermo Fisher) ee luui në käŋ kaa rou ke thëm de mac ye cɔl −50 ku −70 V. MS3 cï kuany ke geei rot në kën yenë käŋ thɔ̈ɔ̈ŋ tueŋ aye luɔ̈ɔ̈i tën thëm de kä ye nyuɔɔth ke TMT. Tɛ̈ŋ de yic de kä cï röt looi acï looi në EASY-nLC 1200, ke luui ë 90% de thëm de thëm de thëm, kenë thëm de thëm de 6% agut cï 31%; FA ë 0.1%, ku B ë 0.1% FA ku 80% ACN. Kë yenë käŋ tïŋ ee luui në 50°C. Luɔ̈ɔ̈i ë FreeStyle (ajuɛɛr 1.6, Käk ë thëm ë thëm) bï athör thɛɛr tek yic cït mɛn tɔ̈u yen në FAIMS ë thëm de thëm de thëm.
Të yenë Protein ŋic thïn ku thööŋ de kä ye kek cam. Në luɔɔi de thëm de wïc de Andromeda cï mat, wël thɛɛr cï keek yök aacï keek caath në luɔɔi de MaxQuant ë thëm 1.5.2.8 ( Në kë mɛtë thïn në Cre recombinase ku YFP cï kek yök tënë Aequorea victoria, ke biäk de peptide acï kek ya wïc në tɛ̈n yenë kek mac thïn ku jɔl ya tɛ̈n yenë kek mac thïn në col yic. Kë ye cɔl methionine ku jɔl ya kë ye cɔl N-terminal acetylation aacï kek ya tääu ëke ye käjuëc wääc ye kek cɔ̈kpiny; cïstïn karbamöyl mëthylëcin acï looi ke ye kë cï tääu bï cɔ̈kpiny. Käk ë thäät ë thäät ë thäät aye keek tääu ë “käŋ ë thäät” ku “trypsin/P”. Ciin thiin de kä ye tɔ̈ në pïu yiic ku kä ye tɔ̈ në razor yic yenëke mïïth ŋic ee 1; ciin thiin koor de kä wääc ke peptides ee 0. Në käke thööŋ de kä ye nyuɔɔth yiic, ke ciin de kä ye yök në mïïth yiic aye 0.01. “Peptide de Rou” acï tääu thïn. Luɔ̈ɔ̈i “thöŋ de kaam de run” ë lööŋ bï yïn kä cï tiɛ̈m yök në kaam de athör thɛɛr wääc yiic. Luɔ̈ɔ̈i LFQ thööŋ thiin koor kuen 1 tënë thööŋ cïn kë cï gɔ̈t (LFQ) (60). Kë ril de LFQ aye nyaai në käŋ kaa rou yiic në akut de genotype tökic në thaar tökic, ku ka ye keek nyaai në tɛ̈n yenë kek tɛkpiny thïn kenë dïtde. 0.3 ku lɔ piny 1.8. Luɔ̈ɔ̈i ë thëm de thëm de Perseus (thɔ̈ɔ̈ŋ de thëm de thëm) ku R (thɔ̈ɔ̈ŋ de thëm de thëm) bï kä cï bɛ̈n bei në LFQ yic ya caath. Thëm de t thëm de kuɛɛr kaa rou tënë käke aliiric ke limma acï luɔ̈ɔ̈i tën kä wääc ke luɔɔi de cɛɛth (61). Cɛɛth de kä cï yök aye looi ke luui ggplot, Kä ye yök në käŋ yiic, kä ye yök në käŋ yiic, GGally ku kä ye nyuɔɔth. Kä cï kek yök në TMT yic aacï kek ya caath në luɔɔi de 1.6.10.43. Kɔɔr wël ke pïïr ë kɔc yiic tënë UniProt, cï yök në pɛɛi de dhoŋuan 2018. Kë cï thɔ̈ɔ̈ŋ anɔŋic kën ë gël de isotope cï bɛ̈i në raan ë loi yeen. Luɔ̈ɔ̈i limma në R yic në thööŋ de kä wääc ke thööŋ. Kä thɛɛr cï yök, kä cï bɛ̈n bei në kë kɔɔric, ku luɔɔi de kä cï yök ke cïïtë yic ku kä cï bɛ̈n bei aye keek tɔ̈ɔ̈u kedhie në mät de ProteomeXchange yic në ɣän ke tɔ̈ɔ̈u ke PRIDE kenë kä cï yök ke kën ye käŋ nyuɔɔth PXD019690.
Kä ye luui aye cïïtë yic cɔk dït. Kë yenë käŋ tïŋ në dhöl de ŋïc (QIAGEN) acï luɔ̈ɔ̈i bïnë kä juëc ke wël ke luɔɔi de kä cï keek gɔ̈t yök në wiik kaa 8 (Thöŋ 1). Në wël lik yiic, ke thööŋ de mïïth cï kek yök në LC-MS/MS (thëm de käjuëc cï kek yök në mïïth yiic) aye kek thɔ̈ɔ̈ŋ në dhɔ̈l käkë yiic: Mus musculus aye kuany ke ye kë tɔ̈ në ye guöp ku jɔl ya tɛ̈n tɔ̈ yen thïn, ku tɛ̈n yenë käŋ tek thïn ee P nyuɔɔth cï thɔ̈ɔ̈ŋ në Benjamini në kë de 0.05 ka tɔ̈ piiny ku ka ye yök ke thiekic. Në ye graph kënë yic, ke käŋ kaa dhiëc tɔ̈ nhial në akutnhïïm yiic cït mɛn de thööŋ de P cï juiir aye nyuɔɔth. Në luɔɔi de t-thëm juëc, në luɔɔi de ajuɛɛr de thëm de käŋ kaa rou ke Benjamini, Krieger, ku Yekutieli (Q = 5%), thëm de kä ye cam në thɛɛr yiic aye looi në kä thiekiic cï keek yök në thëm tökic, ku thëm tökic aye thëm wääc. Acïn kë wïc ba SD thöŋ dɔm.
Në thööŋ de kä cï bɛ̈n bei në ye puɔ̈ɔ̈c kënë yic kenë kä cï kek gɔ̈t ku bï thura de Venn ya looi në Thura 1 yic, ɣok acï lööŋ ke mïïth ke mïïth ke MitoCarta 2.0 ya määt yiic (24). Luɔ̈ɔ̈i ë kë tɔ̈u në aliiric ë Thura de Venn (http.
Të wïc yïn wël juëc apɛi në kuɛɛr ke kuɛ̈n cï ke luɔ̈ɔ̈i tën käke proteomics, ke yïn tïŋ bak thöŋ de Käke Luɔɔi ku Kuɛɛr ke Luɔɔi. Tën kä kɔ̈k ke nyooth abɛ̈n, wël juëc alë bï keek yök tën legend thöŋ. Ke cïn kë cï lueel, kä cï yök abɛ̈n aye keek lueel ke ye kën thööŋë ± SEM, ku käke thööŋ abɛ̈n aacï keek looi në luɔɔi de GraphPad Prism 8.1.2 kën ë luɔi.
Të wïc yïn käŋ juëc kɔ̈k ë athör kënë yic, ka yï tïŋ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1.
Yekënë ee kë cï gɔ̈t ë yök ë thok cï tɛkpiny në lööŋ ke Creative Commons Attribution-Cie-Kë-Cie-Kë-Cï-Kë-Tajir, ye puɔ̈l bï luui, tɛkpiny ku gɛ̈t-piny në gɛɛr de kueer, të cïnë luɔɔi de akër cie kën yök de tajiir ku kë tɔ̈u thïn ee naadɛ̈ ke luɔi thɛɛr ee yic. Wël ye ke lueel.
Tïŋ: Ɣok a wïc yïn ba athör duɔ̈ɔ̈n ë gɛ̈tgɛ̈t tääu-pïny rin bï raan ë gɛ̈tgɛ̈tdu tääu-pïny ŋic lɔn wïc yïn keek bïk gɛ̈tgɛ̈t tïŋ ku lɔn cie gɛ̈tgɛ̈t ë gɛ̈tgɛ̈t. Wek aacïï bï lööŋ ke email dɔm.
Kë thiëc kënë aye looi bï yïn them lɔn yïn ee raan ë yök ku gël ë thäät ë thäät ë thäät.
Në E. Mötörï, I. Atänassöv, SMV Kɔcän, K. Fölz-Dönahuë, V. Säkthïvëlu, P. Gïävälïscö, N. Tönï, J. Puyäl, N.-G. Larson
Cɛɛth cï looi në kä ye röt looi në nhom yiic acï yen bɛ̈n nyuɔɔth ke ajuiɛɛr de metabolism ee rot looi agonë ​​nhom ya cɔk riääk.
Në E. Mötörï, I. Atänassöv, SMV Kɔcän, K. Fölz-Dönahuë, V. Säkthïvëlu, P. Gïävälïscö, N. Tönï, J. Puyäl, N.-G. Larson
Cɛɛth cï looi në kä ye röt looi në nhom yiic acï yen bɛ̈n nyuɔɔth ke ajuiɛɛr de metabolism ee rot looi agonë ​​nhom ya cɔk riääk.
©2020 Akutnhom de Kɔc ke Amɛrika de Käke Luɔɔi. lööŋ kedhiɛ aacï keek tɔ̈ɔ̈u. AAAS ee partner de HINARÏ, AGORA, OARË, CHORUS, CLOCKSS, CROSSREF AND COUNTER. Lɔtueŋ de Nyïc ISSN 2375-2548.